بروتوكول ل HER2 الأسماك باستخدام مثبت أنسجة-الربط بين الصليب وخالية من الفورمالين للجمع بين مزايا الحفاظ على البرد والتثبيت الفورمالين

يتطلب الطب الشخصي أنواعا مختلفة من التحليل من علم الأنسجة الكلاسيكي إلى التحليل الجزيئي ، ويتم إجراء العديد من التقنيات في الموقع على الورم لاختيار أفضل علاج. تسمح تقنيات التحقيق بتقنيات تحليلية مختلفة من عينة واحدة. نوضح هنا ، باستخدام مثبت غير متقاطع في خطوة ما بعد تثبيت الفورمالين البسيطة ، يمكنك استخدام البروتوكولات التي تم تطويرها والتحقق من صحتها في الأصل لمواد البارافين الرسمية والثابتة ، ويمكن استخدامها من عينة الخلية التي تنتج مورفولوجيا جيدة ، وجودة جيدة للحمض النووي الريبي ، ونتائج جيدة للحصول على تهجين في الموقع بشكل أكمل.

ظروف التهجين النموذجية ليست مناسبة للأنسجة الثابتة الخالية من الفورمالين لتوليد نتائج FISH. لقد كشفنا أنه ليس الاختراق ولكن وقت التصحيح الكيميائي هو أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتائج FISH قابلة للمقارنة من الأنسجة الثابتة بالبكتين. فقط القسم المستخدم ل FISH رسمي وثابت لاحقا.

الأنسجة الثابتة المتبقية الخالية من الفورمالين تحليلا جزيئيا فائقا بالنسبة لأنسجة FFP ، كما هو موضح في RTPCR. الإجراء الذي أظهرناه دانييلا بابست ، الفني من مختبري. للبدء ، قم بتقطيع عينات أنسجة سرطان الثدي بمشرط معقم إلى نصفين ، سمك كل منهما أربعة ملليمترات لضمان كمية كافية من الأنسجة.

استخدم حجما قصوى يبلغ 4x15x15 millimiters للتثبيت من خلال محلول الفورمالين القياسي المخزن ، أو من خلال تثبيت الأنسجة البديل غير المتقاطع والخال من الفورمالين. ضع نصف عينة الورم في شريط أنسجة قياسي ، واغمرها في SBFS. ضع النصف الآخر من عينة الورم في محلول التثبيت البديل لمدة 24 ساعة مع نسبة الحجم لكل حجم من أربعة أجزاء مثبتة وجزء واحد من الأنسجة.

بعد ذلك ، انقل العينات الثابتة بدلا من ذلك إلى محلول المثبت لمدة ساعتين إلى 72 ساعة عن طريق فتح الحاوية ، وتحويل كاسيت المناديل بمقدار 180 درجة ، وغمرها. بعد ذلك ، ضع أشرطة المناديل مع العينات الثابتة SBFS في وعاء مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة SBFS المتبقي. بعد معالجة الأنسجة وتضمينها كما هو موضح في بروتوكول النص ، استخدم ميكروتوم لقطع ثلاثة أقسام ميكرون من كتل FFPE و NCFPE.

ضع بعضا من كل نوع من أنواع الأقسام في حمام ماء بارد. التقط القسم العائم بفرشاة رسم دقيقة على شريحة مجهر دقيقة ، وانقله إلى حمام مائي دافئ. التقط الأقسام الممتدة مرة أخرى باستخدام فرشاة الرسم على شريحة المجهر دون أي تجاعيد.

استعد أيضا لعزل الحمض النووي الريبي لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي على نفس العينة عن طريق وضع بعض كل نوع من أنواع الأقسام في قارورة التفاعل. لإزالة البارافينات من أقسام الأنسجة ، نقوم بترطيب الأقسام تدريجيا في درجة حرارة الغرفة في برطمانات التلوين مع 250 مل من الكواشف المختلفة. ضع الأقسام أولا في 100٪ زيلين مرتين لمدة 15 دقيقة ، ثم انقل الأقسام إلى 96٪ من الإيثانول مرتين لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، حرك الأقسام من خلال نسب أقل بشكل تدريجي من الإيثانول ، مع احتضان كل محلول لمدة دقيقتين. أخيرا ، انقل الأقسام إلى المقطر مرتين لمدة 10 دقائق. قم بإجراء تثبيت ما بعد شرائح NCFPE عن طريق وضعها في وعاء تلطيخ جديد مملوء ب SBFS لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

اترك البرطمان في غطاء الدخان خلال خطوة التثبيت لمدة 24 ساعة. والمثير للدهشة أن جميع أوقات ما بعد التثبيت التي تزيد عن 18 ساعة أعطت نتائج مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام مادة البارافين الرسمية والثابتة. قم بإزالة SPFS الزائدة من الشرائح عن طريق غسلها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.

يتبع ذلك بالغسيل الثاني في الماء المقطر لمدة 10 دقائق مرتين. بعد ذلك ، ضع جرة التلوين التي تحتوي على 250 مل من محلول المعالجة المسبقة للحرارة في حمام مائي بدرجة حرارة 98 درجة مئوية. ضع FFPE الرطب في شرائح NCFPE مثبتة بعد التثبيت في البرطمان ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة.

ثم اغسل الشرائح في الماء المقطر لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة في وعاء تلطيخ جديد. بالنسبة لتحلل البروتين ، ضع الشرائح في تهجين يتم التحكم في درجة حرارته عند 37 درجة مئوية. ضع محلول البيبسين الجاهز للاستخدام على الفور بالتنقيط على أقسام الأنسجة حتى يتم تغطيتها بالكامل.

ثم احتضن لمدة تسع دقائق عند 37 درجة مئوية في نظام التهجين. بعد ذلك ، ضع الشرائح في وعاء يحتوي على مخزن غسيل SSC ، واحتضنه لمدة خمس دقائق. ضع الشرائح في الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإجراء تجفيف الأقسام في سلسلة من الكحوليات المتدرجة ، كل منها لمدة دقيقة واحدة. بعد سلسلة الجفاف ، جفف الأقسام بالهواء. للتهجين ، قم بوضع 10 ميكرولترات من مسبار HER2 و Sun 17 المجمعين على أقسام الأنسجة المجففة ، وقم بتغطية كل عينة بزلة غطاء ، وأغلقها بالأسمنت المطاطي.

يقوم الكود بتغيير طبيعة المسبار والعينة من الحمض النووي في نظام التهجين عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ينخفض نظام التهجين تلقائيا إلى 37 درجة مئوية ، ويستمر التهجين بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإزالة الأسمنت المطاطي بعناية وانزلاق الغطاء أيضا باستخدام ملقط لما بعد التهجين والحماية.

احتضن الأحجام في وعاء تلطيخ يحتوي على 37 درجة مئوية 1X buffer A الدافئ مسبقا لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح باستخدام مخزن غسيل 1X مسخن مسبقا مرتين لمدة خمس دقائق عند 27 درجة مئوية. ثم قم بتجفيف الشرائح بنسبة 70٪ 90٪ و 100٪ من الإيثانول في دقيقة واحدة لكل تركيز.

جفف العينات في الهواء ، واحميها من الضوء. للتلوين ، ضع 30 ميكرولترا من محلول DAPI على المنطقة المهجنة ، وتجنب الفقاعات. قم بتغطية الأقسام بزلة غطاء قبل احتضان الأقسام لمدة 15 دقيقة ، محمية من الضوء.

قم بإزالة محلول DAPI الزائد بعناية عن طريق الضغط برفق على الشريحة بين أوراق الترشيح. قم بتخزين الشرائح عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوعين حتى التقييم بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. احصل على الصور باستخدام مرشحات للقنوات الخضراء والبرتقالية.

انتقل إلى تفسير البيانات وتقييم جودة الحمض النووي الريبي كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا المقارنة المباشرة للنتيجة التي تم الحصول عليها من العينة الرسمية والثابتة ، والعينة الثابتة غير المتقاطعة التي تم إصلاحها لاحقا. الإشارات متشابهة الشدة ، والخلفية متشابهة أيضا.

في خلايا الطور البيني الطبيعية ، يوجد عدد متساو من الإشارات الحمراء والخضراء المقابلة لموضع HER2 وموضع مرجع sen 17 مما يدل على عدم وجود تضخيم في جين HER2. يظهر هنا نتيجة حالة أخرى حيث يتم تضخيم جين HER2 ، وهناك إشارة أقوى وأوسع بكثير لموضع HER2 من الجين المرجعي. هذه الظاهرة واضحة في الأنسجة الثابتة الرسمية والثابتة وغير المتقاطعة.

يوضح هذا الرسم البياني فعالية التضخيم لأطوال الهامبليكون المختلفة ل GAPDH mRNA. بالنسبة للفورمالين ، هناك حاجة إلى حوالي 23 دورة ، وبالنسبة للمواد الثابتة غير المتقاطعة ، يتم تقليل هذا إلى 20 دورة. يصبح الاختلاف أكثر وضوحا في الأمبليكونات الأطول مما يشير إلى أن كلا من التجزئة والتعديل الكيميائي يتم تقليلهما بشكل ملحوظ باستخدام مثبتات غير متقاطعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام المفتاح المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لمواد FFPN على مادة ثابتة غير متشابكة عن طريق إضافة خطوة بسيطة بعد التثبيت في إجراء ما قبل التحليل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن القسم المستخدم للتهجين في الموقع الكامل فقط هو للإصلاح اللاحق مع الفورمالين ، في حين أن الكتلة المتبقية ثابتة في المثبت غير المتقاطع ، وبالتالي يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التحليل الجزيئي. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص في سياق الطب الشخصي الحديث عندما يتعين إجراء تحليلات متعددة من أورام صغيرة نسبيا ، ولا تكون معالجة عينات الأنسجة لبروتوكولات مختلفة ممكنة.

علاوة على ذلك ، فإن استخدام مثبت غير متقاطع له ميزة أنه يحافظ على خصائص الأنسجة مثل الحفظ بالتبريد. هذا يتجنب الحاجة إلى تجميد النيتروجين السائل ، والحفاظ على سلسلة التبريد في سياق كيميائي. هذه الاختلافات في جودة الحمض النووي الريبي ليست واضحة ، لذلك عند استخدام مقايسات مراقبة جودة الحمض النووي الريبي الكلاسيكية مثل أرقام سلامة الحمض النووي الريبي ، نظرا لأن هذه المقايسات ليست تكوينية بالكامل في جودة الحمض النووي الريبي المعزولة عن المواد الثابتة والمضمنة في البارافين.