استخدام رقاقة حاسة الشم تكييف موائع جزيئية لتصوير نشاط الخلايا العصبية في الرد على الفيرومونات في الذكور ايليجانس جيم رئيس الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو احتجاز صورة عابرة الكالسيوم بكفاءة في الخلايا العصبية لرأس C.Elegans عند التعرض للفيرومونات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل فهم تنظيم الدوائر العصبية الخاصة بالجنس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الآن تصوير ذكور C.Elegans بكفاءة في جهاز مصيدة السوائل الدقيقة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحميل قد يكون صعبا في البداية ولا تثير الفيرومونات الحيوية عابرة الكالسيوم في كل. لبدء تجميع الخزانات ، قم بإعداد ثلاث مجموعات من الأنابيب عن طريق إدخال إبرة في أحد طرفيها وأنبوب معدني في الطرف الآخر. ثم, لكل خزان, خذ صمام luer ثلاثي الاتجاهات وقم بتوصيل حقنة 30 ملليلتر مع إزالة المكبس, حقنة ثلاثة ملليلتر والأنبوب.

املأ كل خزان بالمخزن المؤقت المناسب ، إما محفز S قاعدي أو S قاعدي يحتوي على الفلورسين. بعد ذلك ، قم بإزالة أي فقاعات هواء من كل من الخزان والأنبوب ، عن طريق النقر على المحقنة وضخها. الآن ، املأ حقنة وأنابيب جديدة بسعة ثلاثة ملليلتر بقاعدة S وأدخلها في منفذ مخرج جهاز السوائل الدقيقة.

ضع القليل من الضغط برفق على المحقنة حتى يظهر المخزن المؤقت على سطح فتحات المدخل. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنابيب خزان التحكم في التدفق والمخزن المؤقت والتحفيز بفتحات المدخل المناسبة ، مما يضمن وجود قطرات السائل على كل من فتحة منفذ التحميل والأنبوب المراد توصيله. الآن ، قم بالضغط برفق على المحقنة حتى تظهر القطرات في مدخل منفذ تحميل الدودة ، ثم أدخل دبوس حجب صلب في هذا المنفذ.

بعد ذلك ، قم بإزالة المحقنة من منفذ المخرج وقم بإرفاق خط مخرج متصل بمنزل الفراغ. الآن ، افحص الجهاز بحثا عن أي فقاعات في القنوات العائمة في موجز الفيديو من المجهر. انقر فوق مباشر ، لمراقبة الصورة الحية وانتظر حتى تتبدد الفقاعات بشكل طبيعي قبل المتابعة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل مصدر ضوء الفلورسنت واستخدم مرشح GFP لتأكيد ديناميكيات التدفق المناسبة. قم بتشغيل صمام الموجات الثلاث ولاحظ أن تيار التحكم في الفلورسنت يظهر في تغذية الفيديو ، عندما يكون الصمام مفتوحا. للبدء ، اختر دودة واحدة على صفيحة أجار NGM غير مصنفة واسمح للدودة بالزحف بعيدا.

ثم ، قم بتعويم اللوحة مع S قاعدية. ارسم المحلول الذي يحتوي على الدودة في المحقنة. الآن ، على الجهاز ، قم بإيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية لإيقاف التدفق باستخدام صمام لور المخرج.

بعد ذلك ، قم بإزالة الدبوس الصلب الذي يمنع منفذ تحميل الدودة. أدخل الأنبوب الذي يحتوي على الديدان في منفذ التحميل. افتح صمام المخرج وراقب تغذية الفيديو الحية.

الآن ، ضع ضغطا برفق على المحقنة حتى تظهر الدودة. اسحب الدودة للخلف إذا دخلت الذيل أولا ، يجب أن تذهب في رأسها أولا لتتعرض للتحفيز. يجب على المستخدم سحب الدودة للخلف قبل أن يدخل الذيل بالكامل إلى القناة ، وإلا فإن إخراج الدودة من القناة أمر صعب للغاية وعادة ما يتطلب شطف الدودة بالكامل عبر القناة وتحميل دودة جديدة.

الآن ، باستخدام الضغط من المحقنة ، قم بدفع الدودة عبر القناة ووضع رأس الدودة ، بحيث تتعرض للتدفق العازل ولكن ليس بعيدا في القناة ، بحيث تكون حرة في الحركة. من المتوقع وجود قدر صغير من الحركة المحورية أو الدورانية في غير المشلولة. على الرغم من أن إضافة مشلول إلى المخازن المؤقتة يكاد يلغي هذا التأثير.

لتقليل احتمالية الحركة أثناء التجربة ، استخدم الذكور الأكبر سنا المحاصرين بشكل أكثر كفاءة ، أو قلل من عرض أو سمك منفذ تحميل الدودة أو قم بزيادة مقدار الوقت الذي تقضيه في الشلل. استخدم البرنامج لعمل تسجيلات باستخدام إثارة الضوء الأزرق. اضبط درجة الإضاءة على 100 مللي ثانية، وافتح نافذة الحصول على الصورة، واضبط النقاط الزمنية على 300 بفاصل زمني عند الصفر، ثم ابدأ الحصول على الصورة.

بعد خمس ثوان ، قم بتطبيق الحافز عن طريق تغيير الصمام ثلاثي الاتجاهات الذي يتحكم في المخازن المؤقتة. يعد التحفيز لمدة 10 ثوان نقطة انطلاق جيدة ويمكن تعديل طول التحفيز حسب الحاجة. بعد التحفيز ، قم بتبديل التدفق مرة أخرى بالضغط على الزر مرة أخرى واستمر في التسجيل حتى يكتمل الفيديو الذي تبلغ مدته 30 ثانية.

هذا يسمح لمضان المعسكر g بالعودة إلى خط الأساس. الآن ، دع التحضير يرتاح لمدة 30 ثانية قبل التجربة التالية. تستجيب الديدان التي تعبر عن g camp three في الخلايا العصبية غير الحساسة ، ASH ، لجلسرين مولي واحد مع تغيرات مرئية في التألق داخل الخلايا العصبية ASH ، مما يدل على النشاط العصبي.

يجب أن تظل الخلايا العصبية في منطقة التحليل للفيديو بأكمله ، وإلا فقد تحدث قطعة أثرية للحركة. إذا كان الأمر كذلك، فقم بتحريك منطقة التحليل لتلك النقاط الزمنية ودمج قيم الكثافة لإنشاء تتبع واحد. الذكور الذين يتم تحفيزهم بالفرمون الحيوي الجذاب الأسكاروسيد ثلاثة أثناء التعرض ، تم قياس عابر الكالسيوم في الخلايا العصبية الأربعة CEM.

من إلى ومن خلية عصبية إلى خلية عصبية ، اختلفت الآثار في الشكل والعلامة والحجم. وبالتالي ، من المهم جدا تحليل العديد من عند دراسة استجابات الفرمون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحميل ذكر C elegans في جهاز مائع دقيق وتحليل عابر الكالسيوم في الخلايا العصبية في الرأس.

يمكن استخدام نفس العملية مع الخنثى ، لتحديد الاختلافات المحددة في الثانية في الاستجابات العصبية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في نصف ساعة لأول تم تصويره. بعد التسجيل الأول ، يمكن تحميل جديد في الصورة في حوالي 10 دقائق.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن دمج طرق أخرى مثل علم البصريات الوراثي مع هذا البروتوكول من أجل فهم كيفية تنظيم الدوائر العصبية بشكل أكبر.