مرحلة السلوك من حويصلات مشحونة بظروف الحل المتماثلة وغير المتماثلة رصدها بالفحص المجهري الأسفار

الهدف العام لهذا البروتوكول هو التقييم الكمي لتأثير بيئات الملوحة العالية وقياس محلول الغشاء الموجود في الظروف الفسيولوجية على حالات طور الغشاء. تختلف المحاليل داخل الخلية والخلايا الخارجية اختلافا كبيرا. تساعد أساليبنا في فهم تأثير قياس المحلول على خصائص الغشاء وسلوك الطور.

الميزة الرئيسية لنهجنا هي أنه يمكن تحضير الحويصلات في ظروف عازلة فسيولوجية ويمكن استخدام جهاز الموائع الدقيقة لإنشاء ظروف عازلة غير متماثلة. لبدء الإجراء ، قم بتخشين جانب واحد من لوحة PTFE بورق صنفرة ناعم. اغسل اللوحة ، قارورة زجاجية سعة 15 مليلتر ، ووعاء زجاجي قابل للغلق بمنظف تجاري لغسل الأطباق والإيثانول والكلوروفورم.

استخدم حقنة زجاجية سعة 25 ميكرولترا لإيداع 10 إلى 15 ميكرولترا من مخزون الدهون في الكلوروفورم على الجانب الخشن من لوحة PTFE النظيفة والجافة. انشر مخزون الدهون بإبرة المحقنة لإنشاء طبقة دهنية موحدة. استخدم الملقط لنقل اللوحة إلى قارورة سعة 15 مل.

سخني الطبق على حرارة 60 درجة مئوية وجففيه لمدة ساعتين لتبخر المذيب. ثم أضف الماء منزوع الأيونات إلى وعاء زجاجي على ارتفاع حوالي سنتيمتر واحد. ضع القارورة مع اللوحة في الحاوية ، مع التأكد من بقائها مستقرة ومنتصبة وإغلاق الحاوية.

اترك الطبقة الدهنية الثنائية تنتفخ مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. ثم أخرج القارورة من الحاوية. ارسم خمسة ملليلتر من محلول التورم في حقنة بلاستيكية وقم بتوصيل مرشح 0.45 ميكرومتر بطرف المحقنة.

أضف محلول التورم المصفى إلى القارورة لترطيب طبقة الدهون. قم بتغطية القارورة وأغلق القارورة بغشاء البارافين البلاستيكي. قم بتخزين القارورة على حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل للحصول على ركام GUV.

قم بتبريد الحويصلات إلى درجة حرارة الغرفة في غضون ساعة من إزالتها من الحرارة. اقطع طرف ماصة بلاستيكية دقيقة سعة 200 ميكرولتر ، بحيث يمكن سحب ركام GUV في الحافة. استخدم طرف الماصة المشذب لنقل الركام و 50 ميكرولترا من محلول التورم إلى قارورة نظيفة وجافة سعة ملليلترين.

أضف إلى القارورة 950 ميكرولتر من محلول التورم الطازج أو محلول متساوي التوتر لتحقيق ظروف محلول متماثل أو غير متماثل على التوالي. قم بضرب الخليط لأعلى ولأسفل ثم اقلب القارورة برفق عدة مرات لإعادة تعليق GUVs. لبدء التقييم ، ضع حصة من تعليق GUV في عازل سيليكون في شريحة مجهرية.

أغلق الغرفة بغطاء غطاء. اسمح للعينة بإعادة التوازن لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، ضع الشريحة على مرحلة العينة من المجهر الفلوري واحصل على صور لما لا يقل عن 30 GUVs لكل دفعة.

افحص الصور لتحديد حالات الطور لصور GUVs. ستكون GUVs في حالة الطور السائل الواحد كروية وناعمة مع ملصق فلوري موزع بشكل متجانس في جميع أنحاء الغشاء. ستكون GUVs في حالة سائل مرتبة ومضطربة من مرحلتين كروية مع ملصق فلوري مقسم إلى مجالات ذات حدود ناعمة داخل الغشاء.

تحقق من أن المجالات حرة في الانتشار على أسطح الحويصلة ويمكن أن تتحد سيتم تقريب GUVs في حالة الطور السائل الصلب ثنائي الطور أو ثلاثي الطور ببعض الحدود الزاوية. يجب ألا تعرض المجالات السائلة على خلفية صلبة انتشارا ، ولكن يجب أن تنتشر المجالات الصلبة بحرية على خلفية سائلة.

بمجرد تحديد حالة الطور لكل صورة GUV ، حدد حالة المرحلة السائدة للدفعة. كرر العملية مع عينات مستقلة إذا كانت حالة المرحلة السائدة أغلبية ضئيلة. قبل استخدام جهاز الموائع الدقيقة ، قم بإعداد ما لا يقل عن خمسة ملليلتر لكل من محاليل تورم السكروز والملح.

قم بتصفية كل محلول من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. بعد ذلك، قم بقص أطراف الماصة البلاستيكية سعة 200 ميكرولتر وضع طرف ماصة في كل قناة من قنوات الجهاز. أضف إلى خزان الجهاز 100 ميكرولتر من محلول التورم الطازج المصفى من نفس النوع المستخدم في تحضير GUVs.

أضف خمسة ميكرولترات من محلول التورم إلى كل طرف ماصة. جهاز الطرد المركزي للجهاز عند 900 مرة G لمدة 10 دقائق لملء قنوات الجهاز. ثم املأ حقنة زجاجية سعة مليلتر واحد بنفس محلول التورم المصفى.

قم بتوصيل طول الأنبوب بالمحقنة. ادفع محلول التورم عبر الأنبوب حتى يتم الضغط على المكبس تماما ويمتلئ الأنبوب بالمحلول. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنبوب بقناة المخرج وقم بتركيب المحقنة على مضخة حقنة.

بعد ذلك ، قم بتوصيل وحدة التحكم في الضغط بمداخل قناة الموائع الدقيقة. تأكد من إغلاق الصمامات ثم اضبط الضغط على ثلاثة أشرطة. ضع جهاز الموائع الدقيقة على مرحلة العينة من المجهر متحد البؤر المقلوب.

استخدم ماصة لإزالة محلول التورم من خزان الجهاز حتى يتبقى 25 إلى 50 ميكرولترا فقط من المحلول. أضف 150 ميكرولترا من نظام التعليق GUV إلى الخزان واخلط التعليق مع سحب العينة اللطيف. قم بتشغيل مضخة الحقنة في وضع السحب بسرعة 10 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 20 دقيقة أو حتى يتم شغل أكثر من 90٪ من مصائد الجهاز.

بعد ذلك ، افتح صمامات وحدة التحكم في الضغط لإغلاق الصمامات الحلقية في جهاز الموائع الدقيقة. أوقف مضخة الحقنة واترك الجهاز يجلس لمدة ساعة واحدة قبل الحصول على صور متحدة البؤر لمركبات GUV في الجهاز. بعد ذلك، استخدم ماصة لإزالة تعليق GUV من الخزان لتترك 25 إلى 50 ميكرولترا فقط.

أضف إلى الخزان 150 ميكرولترا من النوع الآخر من محلول التورم المصفى وقم بسحب الخليط برفق لأعلى ولأسفل. كرر هذه العملية خمس مرات على الأقل لاستبدال المحلول في الخزان بالكامل. قم بتشغيل مضخة الحقنة في وضع السحب بسرعة 10 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 10 دقائق لاستبدال المحلول في القنوات الدقيقة.

ثم قلل معدل التدفق إلى ميكرولتر واحد في الدقيقة. أغلق صمامات وحدة التحكم في الضغط لمدة ثانيتين ثم افتح الصمامات وأوقف مضخة الحقنة. اسمح للجهاز بالجلوس لمدة ساعة واحدة قبل تسجيل الصور متحد البؤر.

لبدء تحضير غرفة التحكم في درجة الحرارة ، قم أولا بتوصيل تركيبات الأنابيب الشائكة بمجموعة تدفق حراري من الألومنيوم مع نوافذ غطاء بسمك ملليمترين. قم بتوصيل فاصل مطاطي بأحد أغطية الغطاء لتشكيل غرفة المراقبة. قم بتحميل 100 ميكرولتر من نظام التعليق GUV في غرفة المراقبة وأغلق الغرفة بغطاء غطاء.

اقلب التجميع ببطء. قم بتوصيل حجرة الألمنيوم بحمام مائي خارجي. قم بتركيب التجميع على مرحلة عينة المجهر.

اضبط الحمام المائي الخارجي على أدنى درجة حرارة مطلوبة واترك النظام يتوازن لمدة 10 إلى 15 دقيقة. احصل على صور لمركبات GUV وحدد حالات الطور في درجات حرارة مختلفة. تم تحضير GUVs من نسب متفاوتة من DOPG والبيض sphingomyelin والكوليسترول في محاليل السكروز أو الملح المتماثلة.

تم تحديد حالات المرحلة المهيمنة عن طريق الفحص المجهري الفلوري. ثم تم نقل التركيبات المختارة إلى ظروف غير متماثلة عن طريق التخفيف لتقييم ظروف الحل الفعالة على سلوك الطور. لمزيد من التحقيق في سلوك طور GUV في المحاليل غير المتماثلة ، تم احتجاز GUVs في جهاز ميكروفلويديك للسماح بالتبادل الكامل للمحلول الخارجي.

تم تقييم GUVs المحاصرة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر قبل وبعد التبادل السائل. تمت مراقبة جزء GUVs المتجانسة إلى المنفصلة عن الطور على نطاق من درجات الحرارة لتقييم درجة الحرارة الفعالة على سلوك طور GUV. لوحظ نمط سيني في البيانات ، والتي كانت بعد ذلك مناسبة لنموذج بولتزمان.

تم تحديد درجة الحرارة التي كان عندها جزء GUVs المفصولة عن الطور 0.5 من المنحنى المجهز. على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسلوك طور الغشاء ، إلا أنه يمكن أيضا استخدام التطبيقات لتجارب أخرى ، مثل دراسة التفاعلات بين الأغشية في الجزيئات الحيوية في الظروف الفسيولوجية.