وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة تأثير العلاجات المحددة ذات الأهمية على هجرة الخلايا في سقالة الفيبرين المرتبطة بالجرح ثلاثي الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التئام الجروح ، حول كيفية تأثير التعديلات في بنية شبكة الألياف على هجرة الخلايا وجلطات الفيبرين في مواقع الجروح ، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة بسيطة وقابلة للتكرار لتحليل هجرة الخلايا داخل جلطات الفيبرين في 3D. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن نقل الكرويات قد يكون صعبا.

ابدأ بتسخين قارورة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية المجمدة لحديثي الولادة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. عندما يتم إذابة الخلايا للتو ، قم بجمعها عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط الخلايا الليفية الجلدية البشرية حديثي الولادة عند 1 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر. ثم قم بزرع الخلايا في قارورة ثقافة T75 لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عندما تصل المزرعة إلى 80٪ من التقاء ، افصل الخلايا بخمسة ملليلتر من التربسين EDTA. بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بتحييد التربسين بخمسة ملليلتر من الوسط الدافئ واخلط 40 ميكرولترا من الخلايا مع التريبان الأزرق بنسبة 1: 1. احتفظ بكمية 10 ميكرولتر من الخلايا للعد.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات عند 1.25 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر. بعد ذلك ، ضع الجزء السفلي من طبق بتري بطول 10 سم بخمسة ملليلتر من PBS المعقم. ثم اقلب غطاء طبق بتري وأضف عدة قطرات 20 ميكرولتر من معلق الخلية على السطح الداخلي للغطاء.

عندما يتم وضع جميع القطرات ، أعد قلب الغطاء على الطبق ، مع الحرص على عدم إخراج القطرات المعلقة وضع الطبق برفق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. في نهاية الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الجلطة لكل كروي لكل بئر ، إلى صفيحة 48 بئر ورجها برفق واضغط عليها للتأكد من أن خليط جلطة الفيبرين يغطي البئر بالكامل. ضع الطبق في الحاضنة لمدة ساعة.

عندما تتبلمر طبقة الجلطة ، تأكد من وجود الكرات الكروية في ثقافة القطرة المعلقة ، تحت مجهر ضوئي وانقل لوحة 48 البئر وطبق ثقافة القطرة المعلقة إلى غطاء مزرعة الخلية. اقلب غطاء طبق بتري بعناية للوصول إلى مزارع القطرات المعلقة واستخدم حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 21 ، لنقل قطرة واحدة إلى كل بئر مطلي بالفيبرين. أتوخى الحذر الشديد عند شفط الكرويات وطلاءها ، حيث أن الخطوة الأصعب والأكثر أهمية في العملية هي نقل الكرويات دون تدميرها.

افحص اللوحة تحت المجهر للتأكد من أن الكرات قد تم زرعها بشكل صحيح في الآبار المناسبة. ضع طبقة برفق من 100 ميكرولتر من محلول الجلطة المحضر حديثا على كل قطرة كروية تحتوي على قطرة وأعد فحص الكرويات تحت المجهر ، للتأكد من أنها لا تزال سليمة وفي وسط كل بئر. ثم أعد صفيحة 48 بئر إلى الحاضنة للسماح للطبقة الثانية من الفيبرين بالبلمرة.

بعد ساعة واحدة ، عالج كل بئر ب 500 ميكرولتر من الوسط المناسب للمجموعة الكروية التجريبية المقابلة وأعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. احصل على صور للكبوتات الكروية عن طريق المجهر الميداني الساطع كل 24 إلى 72 ساعة ، باستخدام مكدس z لعرض المقاطع العرضية المتتالية لثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. بعد ذلك ، في برنامج تحليل الصور المناسب ، تتبع حدود الخلية لكل كروي في كل نقطة زمنية متتالية واستخدم وظيفة القياس للوصول إلى النسبة المئوية للزيادة في المساحة لكل كروي.

بعد ثقافتهم ، في العامل المؤيد أو المضاد للهجرة محل الاهتمام ، يمكن تحديد المناطق الأولية للكبوتيات عن طريق التصوير المجهري للمجال الساطع واستخدامها كمرجع لتحديد درجة نمو الخلايا اللاحقة من الأجسام الكروية في كل نقطة زمنية متتالية. في هذه التجربة التمثيلية ، أظهرت الكرات التي تعرضت لعامل مؤيد للهجرة درجة متزايدة بشكل كبير من الهجرة بعيدا عن الجسم الكروي الأصلي مقارنة بالمركبات المعرضة لعامل مثبط للهجرة أو عامل تحكم. على العكس من ذلك ، أظهرت الكرات المعرضة لعامل مضاد للهجرة درجة انخفاضا كبيرا في الهجرة بعيدا عن الجسم الكروي الأصلي ، مقارنة بالكرات المعالجة بالتحكم

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ساعتين ونصف ، باستثناء وقت زراعة الخلايا ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة الخلايا الكروية وتضمينها لفحوصات هجرة الخلايا في المختبر ثلاثية الأبعاد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية والمناعية للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية توافق بنية شبكة الفيبرين داخل الجلطة أو محاذاة الأكتين في الخلايا الكروية مع زيادة أو انخفاض هجرة الخلايا.

لا تنس أن العمل مع مزارع الخلايا والإبر يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية المناسبة والعمل في غطاء مزرعة معقم ، يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.