الاعتراف الخاصة بتسلسل وانتقائية بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل على الكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل بتعديل كيميائيا الببتيد الأحماض النووية

الهدف العام من مقالة الطرق هذه هو تقديم البروتوكولات التفصيلية التي يستخدمها مختبرنا لدراسة التعرف الجزيئي على الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة بواسطة الأحماض النووية الببتيد المعدلة كيميائيا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الكيميائية للحمض النووي الريبي مثل اكتشاف واستهداف هياكل الحمض النووي الريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن مبادئ التصميم يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على استهداف أي هياكل مزدوجة للحمض النووي الريبي.

سيوضح الإجراء ديزيريه توه ، باحث مشارك من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، أضف أربعة ميكرولترات من محلول الجلسرين بنسبة 35٪ إلى عينات الحمض النووي الريبي PNA المعدة مسبقا واخلطها برفق. باستخدام ماصة دقيقة وأطراف تحميل هلامية ، قم بعناية 20 ميكرولترا من كل عينة إلى جل بولي أكريلاميد معد مسبقا مع التأكد من عدم إدخال أي فقاعات هواء.

قم بتشغيل الجل بجهد ثابت يبلغ 250 فولت لمدة خمس ساعات. بعد خمس ساعات ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإزالة اللوح الزجاجي من حامل الجل. ثم قم بإزالة شريط ختم الجل وتفكيك اللوح الزجاجي.

قم بإزالة الجل برفق من اللوح الزجاجي وضعه في وعاء مملوء ب 350 مل من الماء منزوع الأيونات. أضف بعناية 35 ميكرولترا من بروميد الإيثيديوم إلى الحاوية وضعها على شاكر المنصة على سرعة منخفضة لمدة 30 دقيقة. بعد التخلص من محلول بروميد الإيثيديوم ، اشطف الجل ب 1.5 إلى لترين من الماء المقطر.

ثم امسح الجل ضوئيا باستخدام جهاز تصوير باستخدام ليزر أخضر يبلغ 532 نانومتر ومرشح الانبعاث على 610 نانومتر. تحديد كثافة نطاق الهلام باستخدام البرمجيات الحرة. انقل الكمية المناسبة من 2-أمينوبورين المسمى الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل.

ثم قم بتركيز محاليل الحمض النووي الريبي باستخدام مكثف فراغ. بعد ذلك ، قم بنقل الأحجام المناسبة من الصبغة النووية المستهدفة لتركيزات مختلفة من المخزون الرئيسي المعد مسبقا لفصل أنابيب 1.5 ملليلتر. قم بتركيز محاليل PNA باستخدام مكثف التفريغ.

أضف 975 ميكرولترا من محلول الحضانة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي المجفف واخلطه جيدا لضمان إذابة كل الحمض النووي الريبي. بعد الطرد المركزي لمحلول الحمض النووي الريبي لفترة وجيزة ، قم بإخضاعه للتلدين عن طريق وضع الأنبوب في كتلة حرارية مسخنة مسبقا لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل كتلة الحرارة واترك العينة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

أضف 75 ميكرولترا من الحمض النووي الريبي إلى كل أنبوب من الأنابيب التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المجفف واخلطه جيدا. بعد السماح للعينات بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل ، قم باحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. الآن ، انقل الكميات المناسبة من 2-أمينوبورين المسمى الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة لفصل أنابيب 1.5 ملليلتر.

نقل الأحجام المناسبة من PNA المستهدف لتركيزات مختلفة من المخزون الرئيسي إلى الأنابيب المعنية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة. بعد تجفيف العينات ، أضف 75 ميكرولترا من مخزن الحضانة إلى كل أنبوب واخلطه جيدا. قم بإخضاع كل عينة للتلدين عن طريق وضع كل أنبوب في كتلة حرارية مسخنة مسبقا لمدة 10 دقائق.

بعد السماح للعينات بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، احتضنها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، انقل 70 ميكرولترا من كل عينة إلى كوفيت مربع بحجم سنتيمتر واحد. ضع الكوفيت في مقياس الطيف الضوئي الفلوري وقم بقياس الانبعاث على نطاق الطول الموجي من 330 إلى 550 نانومتر.

بمجرد اكتمال القياس ، قم بإزالة المخزن المؤقت من الكوفيت. اشطف الكوفيت بالماء المقطر وجففه بغاز النيتروجين. بعد تكرار القياس لجميع العينات ، ارسم شدة التألق مقابل الطول الموجي.

نقل الكميات المناسبة من الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة لفصل أنابيب 1.5 ملليلتر. ثم انقل الأحجام المناسبة من PNA المستهدف من المخزون الرئيسي إلى الأنابيب المعنية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة. بعد تجفيف العينات ، أضف 130 ميكرولترا من مخزن الحضانة إلى كل أنبوب واخلطه جيدا.

قم بإخضاع كل عينة للتلدين عن طريق وضع كل أنبوب في كتلة حرارية مسخنة مسبقا لمدة 10 دقائق. بعد السماح للعينات بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، احتضنها عند أربع درجات مئوية طوال الليل. الآن ، انقل 130 ميكرولترا من كل عينة إلى كوفيت من ثماني خلايا ميكروية مع خلية واحدة تحتوي على مخزن حضانة.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية - المرئية ، قم بقياس امتصاص كل عينة عند 260 نانومتر. القياس عند زيادة درجة الحرارة من 15 إلى 95 درجة مئوية متبوعة بانخفاض درجة الحرارة من 95 إلى 15 درجة مئوية بمعدل منحدر 0.5 درجة مئوية في الدقيقة. تم الحصول على أوليغومرات PNA بعد تنقية HPLC في المرحلة العكسية.

يمكن تأكيد هوية PNAs من خلال تحليل MALDI / TOF. تشير بيانات PAGE غير المتناسقة إلى أن PNA المعدل Q و L يمكنه فقط التعرف على منطقة الحمض النووي الريبي مزدوجة الشريطة مع زوج CG. يتم هذا التعرف المحدد والمحسن من خلال التكوين الثلاثي T-A-U-L-G-C و Q-C-G PNA RNA ثنائي الأساس

أظهرت دراسة معايرة التألق 2-أمينوبيورين أن PNA المعدل Q و L يرتبط بالحمض النووي الريبي المستهدف مزدوج الشريطة ولكن ليس الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة. لا تظهر PNAs التي تحتوي على بقايا Q انتقالات ذوبان حراري مما يشير إلى عدم وجود ارتباط بالحمض النووي الريبي أحادي الشريطة بسبب الصدام الفراغي في زوج Watson Watson-Crick مثل QG. بالمقارنة مع PNA P1 غير المعدل ، تظهر PNAs P4 و P5 التي تحتوي على بقايا L درجة حرارة انصهار أقل لثنائيات الحمض النووي الريبي PNA المقابلة بسبب الصدام الفراغي في زوج Watson-Crick مثل LG.

تتوافق بيانات الذوبان الحراري المكتشفة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية مع بيانات معايرة التألق 2-أمينوبيورين والتي تظهر أيضا أن PNA الذي يحتوي على بقايا Q و L لا يرتبط بقوة بالحمض النووي الريبي أحادي الشريطة. يعد دمج قاعدة Q أكثر زعزعة للاستقرار من قاعدة L حيث أن قاعدة Q لها صدام أكثر أهمية في تشكيل زوج Watson-Crick مثل QG. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التجارب المختلفة في غضون أسبوع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل فحص واستهداف هياكل الحمض النووي الريبي في الخلايا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف هياكل الحمض النووي الريبي وتنظيم وظائف الحمض النووي الريبي باستخدام PNAs المرتبطة بالحمض النووي الريبي مزدوجة الشريطة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الحمض النووي الريبي وأمراضه لاستكشاف التطور العلاجي المستهدف لهيكل الحمض النووي الريبي.