وضع نموذج الإكلينيكية البشرية من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف يشترك مع خطوط خلايا سرطان الثدي
سبتمبر 13, 2017
ويصف هذا البروتوكول وضع في المختبر البشري السريري نموذج من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف مع خطوط خلايا سرطان الثدي لمحاكاة التفاعل اوستيوكلاست خلايا السرطان. يمكن استخدام النموذج زيادة فهمنا لتكوين ورم خبيث العظام وتحسين الخيارات العلاجية.
الهدف العام من هذا النموذج قبل السريري البشري في المختبر لتكوين العظم المشتق من خلايا الدم المحيطية ، أو PBMCs ، المزروعة بخطوط خلايا سرطان الثدي هو تقليد تفاعلات ناقضات العظم في الخلايا السرطانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ورم خبيث في العظام حول تأثيرات تفاعل الخلايا السرطانية والخلايا العظمية داخل البيئة المكروية للعظام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نموذج بشري بالكامل قبل السريري.
أيضا ، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على ورم خبيث في العظام. يمكن تطبيقه أيضا على دراسة الآليات المرضية الأخرى المتعلقة بالعظام ، مثل هشاشة العظام. قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التباين بين المتبرعين الأصحاء وفي اختيار كثافة خلايا PBMC المناسبة.
يعدالعرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنهم بحاجة إلى رؤية خطوات اختيار PBMC والبذر الخاصة بنا تتطلب بعض الخبرة اليدوية قبل تحقيق الكفاءة. ابدأ بتخفيف ما لا يقل عن 20 مل من الدم الكامل للمتبرع الأصحاء في EDTA بنسبة واحد إلى واحد في PBS. بعد الخلط جيدا ، قسم محلول الدم إلى 30 مليلتر في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
ضعبعناية 15 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية في قاع كل أنبوب. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. واسحب الخلية البيضاء أحادية النواة التي تحتوي على معاطف مصفاة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل.
اغسل الخلايا المحصودة مرتين في 20 مل من PBS لكل غسلة ، متبوعا بتحلل خلايا الدم الحمراء بخمسة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق ، على الثلج. أوقف التفاعل ب 20 مل من PBS ، واجمع خلايا الدم البيضاء عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات وأكمل ألفا إم إم للعد.
بعد ذلك ، قم بوضع الخلايا عند سبع نقاط خمسة في 10 إلى خمسة PBMC لكل سنتيمتر مربع في كل بئر من صفيحة 24 بئرا لحضانة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة ثاني أكسيد الكربون2. بعد حوالي ثلاث ساعات ، قم بإزالة المادة الطافية والحطام والخلايا غير المرتبطة وكريات الدم الحمراء غير المتحللة من الثقافات. وأضف وسيطا طازجا ، مكملا ب MCSF.
بعد أربعة عشر يوما من البذر ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، وثبتها في أربعة بالمائة بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء تلطيخ المصيدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ستكون الخلايا الشبيهة بناقضات العظم إيجابية TRAP مع أربع نوى على الأقل.
عد الخلايا الشبيهة بناقضات العظم يدويا تحت المجهر بتكبير 10 أضعاف. بالنسبة لتمايز ناقضات العظم التي تسببها الخلايا السرطانية عندما تصل الخلايا السرطانية إلى التقاء تسعين بالمائة ، يتم فصلها عن طريق التربسين ويتم زرعها في إدخالات مسام بمقدار أربعة ميكرومتر عند أربعة أضعاف 10 إلى ثلاث خلايا لكل سنتيمتر مربع تركيز في ألفا MEM الطازج. في اليوم التالي ، ضع الإدخالات المصنفة فوق مزارع الخلايا أحادية النواة المطلية غير المتمايزة ليوم واحد في ALPHA M-E-M الكامل ، وقم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام.
بعد ذلك ، بعد 11 يوما من بدء الزراعة المشتركة ، قم بنقل الإدخالات إلى صفيحة جديدة تحتوي على الكاشف المناسب لتحليل المصب المطلوب. يمكن لخلايا سرطان الثدي أن تحافظ على تكوين العظم ، حيث أن عدد ناقضات العظم في الآبار التي تسببها الخلايا السرطانية مشابه لتلك التي يتم الحصول عليها في آبار التحكم في عامل النمو الإيجابي. ومع ذلك ، يتم تقليل عدد ناقضات العظم التي لوحظت في جميع الثقافات ، عندما يتم علاج الخلايا بدواء مضاد للورم.
ومن المثير للاهتمام أن المساحات السطحية لناقضات العظم الناضجة المشتقة من عوامل النمو أكبر من تلك التي تسببها الخلايا السرطانية. لا يلاحظ هذا التأثير في الثقافات المعالجة بالأدوية المضادة للأورام. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في سبع وثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل إضافي للمصب مثل تحليل التعبير الجيني ، أو Western Blot ، أو تحليل التألق المناعي ، أو ELISA للإجابة على أسئلة إضافية حول تفاعلات الخلايا السرطانية / الخلايا العظمية أو حول آليات الأدوية المضادة للورم. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ورم خبيث في العظام لدراسة البيئة الدقيقة للعظام ، في نموذج قبل السريري البشري بالكامل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الزراعة المشتركة للخلايا الوحيدة ، والخضوع للتمايز مع الخلايا السرطانية.
لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية والأدوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تطوير نموذج بشري قبل سريري في المختبر لعملية تكوين ناقضات العظم (osteoclastogenesis) من خلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي مستنبتة مع خطوط خلوية لسرطان الثدي لمحاكاة التفاعل بين الخلايا السرطانية وناقضات العظم. يمكن أن يساعد هذا النموذج في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالنقائل العظمية وتحسين الخيارات العلاجية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- تكون الخلايا الهادمة للعظم
- النقائل العظمية
- تفاعلات الخلايا السرطانية
خلفية علمية
- يستخدم النموذج الخلايا الوحيدة في الدم المحيطي (PBMCs).
- يهدف إلى محاكاة التفاعلات بين الخلايا السرطانية وناقضات العظم.
- يُعد هذا البحث هاماً لفهم الأمراض المرتبطة بالعظام.
- يمكن أن يؤثر التباين بين المتبرعين الأصحاء على النتائج.
الغرض من الدراسة
- لمحاكاة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا الناقضة للعظم.
- لاستقصاء آثار هذه التفاعلات ضمن البيئة الدقيقة للعظم.
- لتقديم رؤى حول النقائل العظمية والحالات المرضية المرتبطة بها.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) مع خطوط خلايا سرطان الثدي.
- تقييم عملية تكون ناقضات العظم.
- تقييم التفاعلات بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام.
- تحليل التباين في كثافة خلايا PBMCs.
النتائج الرئيسية
- يحاكي النموذج بنجاح التفاعلات بين الخلايا السرطانية وناقضات العظم.
- يمكن للرؤى المكتسبة أن تساهم في تطوير الاستراتيجيات العلاجية لانتشار السرطان في العظام.
- تمتد التطبيقات المحتملة لتشمل أمراض العظام الأخرى.
- تشمل التحديات تباين المتبرعين واختيار كثافة الخلايا.
الاستنتاجات
- يُعد هذا النموذج البشري قبل السريري ذا قيمة عالية لدراسة النقائل العظمية.
- وهو يعزز فهم التفاعلات بين الخلايا السرطانية في البيئة المجهرية للعظام.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذا النموذج في تطبيقات أوسع في أمراض العظام.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا النموذج قبل السريري البشري الكامل تقليل المخاطر الميكانيكية للمسارات المحفزة لتكون الخلايا الهادمة للعظم في النقائل العظمية، وذلك من خلال محاكاة التآثر المتبادل بين الخلايا السرطانية والخلايا الهادمة للعظم في نظام ذي صلة فسيولوجياً. كما يدعم هذا النموذج التحقق من الأهداف وتطوير المقايسات للعلاجات المضادة للأورام عبر توفير قراءات كمية لتمايز الخلايا الهادمة للعظم ووظائفها. ويعزز النموذج الثقة التنبؤية في تحديد المركبات الرائدة من خلال السماح بالملاحظة المباشرة للتفاعلات المتبادلة والتحليل اللاحق لكلا النوعين من الخلايا تحت ظروف العلاج الدوائي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بعملية تكوين ناقضات العظم الناتجة عن الأورام وتوضيح المسارات في البيئة المجهرية للعظم.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية والتحقق من الأهداف الوظيفية من خلال نمذجة تمايز ناقضات العظم من الوحيدات البشرية الأولية في ظل ظروف زراعة مشتركة محددة.
- القيمة العلمية: تسهل الثقة التنبؤية وفرز المحافظ العلاجية عن طريق قياس تكوين ناقضات العظم استجابةً لمحفزات الخلايا السرطانية مقابل ضوابط عوامل النمو.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية تم التحقق من صحتها لسير العمل اللاحق من خلال تمايز ناقضات العظم القياسي من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) باستخدام RANKL وMCSF.
- القيمة التشغيلية: معالجة توحيد المقايسة وقابلية تكرارها عبر استزراع كثافة خلوية ثابتة (7.5×10⁵ PBMC/cm²) وتمايز محدد زمنياً (14 يوماً) مع قياس كمية ناقضات العظم بناءً على TRAP.
- القيمة العلمية: تمكين التقييم الموثوق للمركبات عن طريق اختبار تأثيرات الدواء على تكوين ناقضات العظم في تنسيقات الزراعة المشتركة غير المباشرة (الوسط المشروط) والمباشرة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم نمذجة الصلة المرضية لهشاشة العظام وحالات العظام الأخرى من خلال تطويع مقايسة تكوين ناقضات العظم.
- القيمة التشغيلية: يضمن الاستمرارية الانتقالية باستخدام خلايا بشرية بالكامل، مما يقلل من مخاطر الترجمة بين الأنواع عند الاستقراء من المرحلة قبل السريرية إلى المرحلة السريرية.
- القيمة العلمية: يتيح اتخاذ قرارات تقدم معدلة حسب المخاطر عن طريق قياس التغيرات في عدد ناقضات العظم ومساحة سطحها كعلامات حيوية للديناميكا الدوائية لفعالية الدواء.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
يتناسب هذا النموذج مع تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف ووصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم اختبار الفعالية قبل السريرية، وبوجه خاص للعلاجات التي تستهدف العظام ومعدلات البيئة الدقيقة للعظام.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالعوامل المشتقة من الخلايا السرطانية في تنشيط ناقضات العظم، وتوضيح مسارات آليات تحفيز ناقضات العظم المستقلة عن RANKL.
- الفحص: توفر الجاهزية للفحص من خلال عمليات عزل وتمايز الخلايا الوحيدة الموحدة، والزراعة المشتركة مع خطوط خلايا سرطان الثدي على أغشية نفاذة لدراسة إشارات التآثر المجاورة (paracrine) والتآثر الملاصق (juxtacrine).
- التحليلات: توفر قراءات كمية لناقضات العظم عبر صبغ TRAP، وعد الخلايا متعددة النوى، والتحليل المورفومتري (مساحة السطح) لمقارنة الظروف التجريبية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين الاستمرارية قبل السريرية من خلال تمكين دراسة تأثيرات الأدوية على البيئة الدقيقة للعظام النقيلية باستخدام خطوط خلايا سرطان الثدي ذات الصلة سريرياً.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة تعديل ناقضات العظم عبر أنواع متعددة من السرطانات وأمراض العظام بما يتجاوز سرطان الثدي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في التفاعلات بين الخلايا الهادمة للعظم والخلايا السرطانية.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال بروتوكولات محددة لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)، وكثافة الاستزراع، وتكميل السيتوكينات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين التقييم المبكر لتأثيرات العقاقير على تكوين الخلايا الهادمة للعظم ووظيفتها، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج نقائل العظام.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال قياس القدرة التحفيزية لتكوين الخلايا الهادمة للعظم للمركبات، وتوجيه التقدم بناءً على تعديل البيئة الدقيقة للعظام.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات عزل الخلايا البشرية الأولية وزراعتها وتمايزها، بما في ذلك فصل خلايا PBMC والتصاق الخلايا أحادية النواة.
- يعتمد على أجهزة عد الخلايا، والطرد المركزي، والمجهر (تكبير 10X لعد الخلايا الهادمة للعظم)، والحضانة (37°C، 5% CO₂).
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص مصادر المتبرعين بخلايا PBMC، وتحسين كثافة الخلايا (7.5×10⁵ PBMC/cm²)، وتوقيت الزراعة المشتركة (بعد 11 يوماً من استزراع الخلايا السرطانية) لتقليل التباين.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند التوسع في استخدام خطوط خلوية لسرطانات غير سرطان الثدي أو محفزات بديلة للخلايا الهادمة للعظم بخلاف RANKL/MCSF.
- يشمل قيوداً عملية مثل التباين بين المتبرعين في إمكانية تمايز الخلايا الهادمة للعظم، والحاجة إلى الكفاءة اليدوية في استزراع PBMC وإعداد الزراعة المشتركة.
