جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد سلالات مستهدفة من المكورات العقدية الطافرة المعطلة جينيا باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الاندماجي المكون من خطوتين والتثقيب الكهربائي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة مثل كيفية عمل الجين ذي الأهمية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يلزم وجود تفاعل إنزيمي بخلاف تفاعل البوليميراز المتسلسل وأن إعداد الخلية المختصة للتثقيب الكهربائي بسيط للغاية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتقنية تعطيل جين العقدية الطافرة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأنواع الميكروبية الأخرى مثل المكورات العنقودية الذهبية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم ليسوا على دراية بفعالية البادئات المتداخلة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. سيوضح الإجراء الدكتور أياكو أوكادا ، مدرب أبحاث من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء ، قم بتخزين S.mutans UA159 على ضخ قلب الدماغ أو لوحة أجار BHI واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف لاهوائية. في اليوم التالي ، استخدم عود أسنان معقم لاختيار مستعمرة واحدة وتلقيحها في خمسة ملليلتر من مرق BHI. احتضان ثقافة S.mutans بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف لاهوائية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 2000 مرة G لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من PBS. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 2000 مرة G لمدة 15 دقيقة. أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة في 200 ميكرولتر من PBS. استخرج الحمض النووي الجيني من المعلق باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني القائمة على الخرز. أولا ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب عينة سعة ملليلتر يحتوي على خرز زجاجي. ثم أضف 750 ميكرولتر من محلول التحلل إلى تعليق الخلية. قم بتغطية الأنابيب بإحكام وضعها بشكل متماثل في حامل الأنبوب لجهاز تعطيل ضرب الخرز. العملية بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي للعينات المخفوقة بالخرز عند 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. انقل المادة الطافية إلى عمود دوران في أنبوب تجميع سعة ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 7000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. أضف 1200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط بالحمض النووي إلى المرشح وانقل 800 ميكرولتر من الخليط إلى عمود الدوران في أنبوب تجميع سعة ملليلتر. جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. تجاهل التدفق. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المسبق إلى عمود الدوران لغسل مصفوفة العمود وجهاز الطرد المركزي 10 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق ، وأضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى عمود الدوران لغسل مصفوفة العمود وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. ضع كل عمود دوران في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى مصفوفة العمود. جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 مرة G لمدة 30 ثانية لمسح الحمض النووي الجيني. قم بتقدير تركيز الحمض النووي ونقاءه عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر و 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يتم إجراء أول تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام جينوم النوع البري S.mutans وجين مقاومة الستربتومايسين الاصطناعي كقوالب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم استخدام ثلاث مجموعات من البادئات لتضخيم المنطقة المرافقة للمنبع لجين glycosyltransferase C أو gtfC ، ومنطقة المرافقة النهائية لجين gtfC وجين مقاومة السبيكتينومايسين. قم بتجزئة كل منتج من منتجات PCR على جل الاغاروز بنسبة 1٪. يجب أن يكون حجم كل منتج من أول تفاعل البوليميراز المتسلسل كيلوبايت واحدا تقريبا. استخدم قاطع نطاق هلام لاستئصال النطاقات المقابلة وتنقية كل منتج من منتجات الحمض النووي المضخم كما هو موضح في بروتوكول النص. الخطوة التالية هي استخدام الأجزاء المولية الثلاثة المتساوية تقريبا كقوالب PCR لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. يتم تضخيم هذه الأجزاء وتقسيمها باستخدام مواد أولية مناسبة لإنتاج بنية الاضطراب. نظرا لأن نجاح هذا الإجراء يعتمد على تضخيم بنية الاضطراب بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني ، فمن المهم تأكيد منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني عن طريق الرحلان الكهربائي. قم بتحميل 1/10 من خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام الاغاروز 0.8٪ للتأكد من أن الأمبليكون المتولد له حجم النطاق المتوقع. في هذا المثال ، أعطت البادئات المتداخلة تضخيما أفضل بكثير. انقل خليط PCR المتبقي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر وأضف 55 ميكرولترا من الماء فائق النقاء لضبط الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر. أضف 1/10 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار درجة الحموضة 5.2 ، متبوعا ب 2.5 حجم من 100٪ إيثانول واخلطه ، قم بالتجميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي عند 15 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. عند الانتهاء من الطرد المركزي ، تحقق من وجود الحبيبات في قاع الأنبوب. تخلص من المادة الطافية. اغسل الحبيبات بمليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي عند 15, 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وجفف الحبيبات بالهواء لمدة 30 دقيقة تقريبا. أخيرا ، قم بإذابة الحبيبات ب 10 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. تم تحضير خلايا S.mutans UA159 المختصة مسبقا وتخزينها على شكل 50 ميكرولتر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.امزج كل 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة بالجليد مع خمسة ميكرولترات من بنية التعطيل. أضف الخليط إلى كوفيت التثقيب الكهربائي بمسافة 0.2 سم بين الأقطاب الكهربائية. قم بإجراء التثقيب الكهربائي باستخدام وضع المكورات العنقودية الذهبية لجهاز التثقيب الكهربائي. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، قم بتعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مرق BHI وأضف 50 ميكرولترا من التعليق إلى ألواح أجار BHI المحتوية على سبيكتينومايسين. احتضن الأطباق لمدة يومين إلى ستة أيام في 37