الشرطي ضربة قاضية للتعبير الجيني في خطوط خلايا السرطان لدراسة توظيف حيدات/الضامة إلى ورم المكروية

يتمثل هذا البروتوكول بشكل عام في استخدام الضربة القاضية المشروطة للتعبير الجيني في الخلايا السرطانية لدراسة تجنيد الخلايا الوحيدة والضامة في البيئة المكروية للورم في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيئة المكروية للورم فيما يتعلق بطبيعة المخزون المتقاطع بين الخلايا السرطانية وخلايا الجهاز المناعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النظام المستخدم هنا يتطلب استنساخا متجها أحادي التوجيه ، ويسمح بالتوليد السريع للنسخ المتعددة ، ويظهر مستويات منخفضة جدا من السماكة.

كما تم توضيح طريقة لتنقية الخلايا الوحيدة البشرية دون الاتصال المباشر بالأجسام المضادة والتي تتجنب التنشيط العرضي بينما تؤدي إلى أكثر من 95٪ من السكان الوحيدات البشرية. لإنتاج جزيئات فيروسية ، قم بنقل أطباق متجمعة بنسبة 70٪ 150 ملم من خلايا HEK-293 مع 25 ميكروغراما من pLKO-tet-on shRNA ، و 25 ميكروغراما من بلازميد تغليف psPAX ، وخمسة ميكروغرامات من البلازميد pMD2 الذي يعبر عن المغلف. G باستخدام كاشف الإرسال وفقا للبروتوكولات القياسية.

أضف المزيج إلى أطباق 150 ملم. في اليوم التالي ، قم بتحفيز إنتاج الفيروسات العدسية في الخلايا عن طريق تغيير الوسط إلى DMEM المكمل ب 10 مللي مولار من زبدات الصوديوم و 20 مليمولر هيبيس. استزراع لمدة ثماني ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد ثماني ساعات ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف 25 مل من وسط DMEM الطازج مع 20 ملليمولار HEPES وبدون زبدات الصوديوم. بعد الحضانة لمدة 48 ساعة ، اجمع الوسط المحتوي على الفيروس بعناية باستخدام ماصة. لتوليد خطوط خلوية مستقرة ، ابدأ بزرع خلايا سرطان القولون HCT-116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في صفيحة مكونة من 12 بئرا و 50،000 خلية لكل بئر.

احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 60-70٪ ، اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف ملليلترا واحدا من الوسط المحتوي على الفيروسات إلى كل بئر. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط المحتوي على الفيروس بعناية عن طريق الشفط.

ثم بعد غسل الخلايا باستخدام PBS ، أضف وسيطا يحتوي على FBS خال من التتراسيكلين. بعد 72 ساعة ، اغسل الخلايا كما كان من قبل وأضف وسيطا مكملا بميكروغرام واحد لكل مليلتر بورومايسين لاختيار الخلايا المنقولة بالفيروسات. حدد الخلايا المنقولة بالفيروسات عن طريق زراعة الخلايا في وجود بورومايسين لمدة ثلاثة إلى 14 يوما.

لاحظ القتل الجزئي للآبار بواسطة بورومايسين في الخلايا ذات الخلايا المنقولة بالفيروسات. لن تنمو الخلايا غير المنقولة في وجود بورومايسين. عندما تموت خلايا التحكم هذه ، استمر في زراعة خطوط الخلايا المنظمة بشكل مشروط لمدة أسبوعين في وجود المضادات الحيوية لإنشاء خطوط الخلايا المنظمة بشروط.

التحقق من كفاءة الضربة القاضية المشروطة في سرطان القولون HCT-116 المقاوم للبورومايسين وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 عن طريق إضافة وسط بتركيزات مختلفة من الدوكسيسيكلين وزراعة الخلايا لمدة 72 ساعة. بعد تحضير محللة الخلية ، تحقق من مستوى الضربة القاضية عن طريق تحليل اللطخة الغربية. يتم عرض مستويات PAI-1 هنا.

لعزل الخلايا الوحيدة في الدم المحيطي ، قم أولا بإعداد ثلاثة أنابيب سعة 50 مليلتر تحتوي على 15 مل من محلول تدرج الكثافة. ثم استخدم وحدة تحكم ماصة مضبوطة على تدفق الجاذبية لوضع طبقة ببطء 30 مل من الدم المخفف فوق محلول تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 400 جم في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع لمدة 25 دقيقة.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من الطبقة العليا وانقل الطبقة الوسطى التي تحتوي على خلايا الدم المحيطية أحادية النواة إلى أنبوب جديد سعة 50 مليلتر وأضف FBS المكمل ب PBS حتى 50 ملليلترا. جهاز طرد مركزي عند 120 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة المطفية المحتوية على الصفائح الدموية.

بعد الطرد المركزي النهائي والتجميع ، قم بتعليق الحبيبات في 50 مل من FBS المكملة ب PBS وعد خلايا الدم المحيطية أحادية النواة باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد الطرد المركزي للخلايا عند 120 جم ، أعد تعليق الحبيبات في FBS المكملة ب PBS التي تحتوي على EDTA واحد مليمولار إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مليون خلية لكل مليلتر. ثم ابدأ في إثراء الخلايا الوحيدة عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة للاختيار السلبي لكل مليلتر من تعليق الخلية وخلطها.

احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل مليلتر ، واخلطه واحتضنه لمدة 10 دقائق أخرى. ثم أضف PBS مع FBS و EDTA حتى 25 مل وضع خليط الدم المحيطي أحادي النواة في مغناطيس يمكن أن يستوعب أنبوب 50 ملليلترا.

بعد الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ستلتصق الخرزات المغناطيسية بجدران الأنبوب وتعزل الخلايا غير أحادية الخلية عن المحلول. استخدم ماصة سعة 25 ملليلتر لإزالة محلول يحتوي على خلايا وحيدة من الأنبوب مع الحرص على عدم لمس جوانب الأنبوب بالماصة. بعد الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية ، قم بإعادة تعليق الحبيبات التي تحتوي على خلايا وحيدة في وسط RPMI يحتوي على 10٪ FBS خال من TET و 1٪ بقلم عقدي.

ابدأ الاختبار عن طريق بذر 40،000 خلية HCT-116 أو MDA-MB-231 بحجم 0.5 مليلتر في آبار صفيحة 24 بئرا بثلاث نسخ. في اليوم التالي ، أضف مرشحا إلى البئر. ثم ضع 8 ، 000 خلية وحيدة بحجم 0.3 مليلتر على غشاء مسامي معالج ب BSA يوضع في الجزء العلوي من الخلايا السرطانية ويحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

اجمع الإدخالات بعد 48 ساعة. تخلص من الوسط الزائد واسحب السطح الداخلي بدقة باستخدام قضيب قطني لإزالة الخلايا التي لم تهاجر. قم بتلطيخ الجانب الخارجي من الملحق باستخدام طريقة Wright-Giemsa.

بعد تركيب المرشحات مع وضع جانب البلاعم المنتقل لأعلى ، قم بتصوير الشرائح باستخدام مجهر ضوئي بهدف 20 قوة. التقط صورا لتسعة حقول لكل عامل تصفية وحساب البلاعم التي تم ترحيلها في جميع الحقول. تم استخدام اختبار غرفة بويدن لتحديد هجرة الخلايا الوحيدة نحو الخلايا السرطانية.

في وجود خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 ، تم تثبيط هجرة الخلايا الوحيدة بنسبة 33٪ بعد إضافة الدوكسيسيكلين إلى الثقافة المشتركة لتقليل تنظيم PAI-1. كان هذا التثبيط لهجرة الخلايا الوحيدة أكثر وضوحا في وجود خلايا سرطان القولون HCT-116 حيث أدى الضربة القاضية ل PAI-1 عن طريق إعطاء الدوكسيسيكلين إلى تقليل هجرة الخلايا الوحيدة بنسبة 74٪ لوحظت نتائج مماثلة عندما تم وضع الظروف المتوسطة للخلايا السرطانية المعالجة بالدوكسيسيكلين في قاع الآبار كمصدر للجاذبات الكيميائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نظام tet-on وظيفي للضربة القاضية للتعبير الجيني في خطوط الخلايا السرطانية البشرية لدراسة تأثير الجاذب الكيميائي للبروتين المفرز المشتق من السرطان PAI-1 على الخلايا الوحيدة البشرية.