التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد وتحديد أكثر من 10000 بروتين من محللات الخلايا أو الأنسجة بدقة عبر علاجات دوائية مختلفة أو دورات زمنية أو ظروف بيولوجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب أو علم الأحياء مثل البروتينات التي تتغير استجابة لدواء أو محفزات بيولوجية أخرى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتمتع بالقدرة على تحديد أكثر من 70٪ من البروتين المعبر عنه بدقة على مدار 10 ظروف تجريبية مختلفة.

يمكن أن تمتد الآثار المترتبة على هذه التكنولوجيا إلى تشخيص الأمراض التي تصيب الإنسان من خلال اكتشاف المؤشرات الحيوية المحتملة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يلعب التحلل الأمثل للخلايا وتقدير السوائل دورا رئيسيا في إجراءات الهضم ووضع العلامات والفصل. لبدء هذا البروتوكول ، احصل على الخلايا المستنبتة ذات الأهمية.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من PBS لكل غسلة. اكشط واجمع الخلايا المغسولة في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على مليلتر واحد من PBS. جهاز طرد مركزي عند 600 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وتخزينها على درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لتحلل الخلايا. اجمع الأنسجة المرغوبة ووزنها بسرعة بعد التشريح. بعد ذلك ، قم بتخزينها على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل في يوم التجربة كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف المخزن المؤقت للتحلل إلى العينة المجمدة بحيث تكون نسبة المخزن المؤقت إلى العينة 10 إلى واحد وتركيز البروتين النهائي بين خمسة و 10 ملليغرام لكل مليلتر. بعد ذلك ، أضف حبات زجاجية واستخدم الخلاط لتحلل العينات عند أربع درجات مئوية وتسريع ثماني عن طريق الخلط لمدة 30 ثانية ثم الراحة لمدة خمس ثوان ، وكرر ذلك خمس مرات أو حتى تتجانس العينات.

قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة كمية البروتين القياسية أو جل SDS بولي أكريلاميد الملون بالكوماسي مع BSA كمعيار. بعد ذلك ، أضف 100٪ أسيتونيتريل بحيث يكون التركيز النهائي 10٪ ويكون بروتياز Lys-C بنسبة إنزيم إلى ركيزة من واحد إلى 100. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين للسماح بهضم البروتين.

ثم أضف DTT بحيث يكون التركيز النهائي ملليمولار واحدا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك ، أضف 50 ملليمولار HEPES حتى يتم تخفيف تركيز اليوريا في العينات إلى ضرسين.

أضف التربسين إلى كل عينة بنسبة التربسين إلى البروتين من واحد إلى 50. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات على الأقل. بعد ذلك ، أضف DTT حتى يصبح تركيزه مرة أخرى ملليمولار واحد واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

أضف اليودوأسيتاميد بحيث يكون تركيزه النهائي 10 ملليمولار. احتضن في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإخماد أي يودوأسيتاميد غير متفاعل عن طريق إضافة DTT بحيث يكون تركيزه النهائي 30 ملليمول.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تحقق من كفاءة هضم التربسين كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، أضف TFA إلى كل عينة بحيث يكون التركيز النهائي 1٪ باستخدام شريط الأس الهيدروجيني ، قم بقياس الرقم الهيدروجيني لكل عينة للتحقق من أنه بين اثنين وثلاثة.

أضف إضافة TFA إضافيا إذا لزم الأمر للوصول إلى درجة حموضة غير مقبولة. الطرد المركزي للعينات عند 20 ، 000 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. اجمع المادة الطافية وقم بتحميل العينات على أعمدة الدوران المعدة.

جهاز طرد مركزي عند 100 مرة جم لمدة ثلاث دقائق أو حتى تمر العينة بالكامل عبر العمود لربط العينات. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من 0.1٪ TFA إلى كل عمود. جهاز طرد مركزي بمعدل 500 مرة جم لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، أضف 125 ميكرولترا من محلول يحتوي على 60٪ أسيتونيتريل و 0.1 TFA لكل عمود. جهاز طرد مركزي عند 100 مرة جم لمدة ثلاث دقائق لإزالة الببتيدات من العمود. أعد تكوين كل عينة ببتيد محلية في 50 ميكرولتر من 50 مليمولار HEPES.

باستخدام شريط الأس الهيدروجيني ، تحقق من أن الرقم الهيدروجيني لكل عينة يتراوح بين سبعة وثمانية. بعد ذلك ، قم بإذابة كواشف TMT في الأسيتونيتريل اللامائي ، وأضفها إلى العينات ، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، استخدم 10 أطراف ماصة ميكرولتر مدمجة مع وسائط كروماتوغرافيا لتحلية ميكروغرام واحد من كل عينة وتحليل كفاءة وضع العلامات كما هو موضح في بروتوكول النص.

افحص ستة إلى 10 ببتيدات منفصلة للتأكد من عدم اكتشاف الببتيدات غير المسماة في العينات المصنفة. ثم امزج ما يقرب من ميكرولترين من كل عينة معا. استخدم أطراف ماصة سعة 10 ميكرولتر مدمجة بوسائط كروماتوغرافيا لتحلية هذا الخليط.

قم بتحليل العينات بواسطة LC-MS/MS كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء ، قم بإذابة عينة الببتيد المجمعة المحلية والمصابة ب TMT في 65 ميكرولترا من المخزن المؤقت أ.استخدم شريط الأس الهيدروجيني للتحقق من أن الرقم الهيدروجيني يبلغ حوالي 8.0. إذا كانت العينة لا تزال حمضية ، فاستخدم هيدروكسيد الأمونيوم لضبط درجة الحموضة حسب الضرورة.

بعد ذلك ، قم بتجزئة العينة كما هو موضح في بروتوكول النص. اضبط مجمع الكسور لجمع الكسور كل دقيقتين بما في ذلك وقت التحميل. اضبط معدل التدفق على 0.4 مل في الدقيقة.

اجمع ما مجموعه 80 كسورا. بعد ذلك ، استخدم مكثف فراغ لتجفيف كل عينة أخرى تماما. باستخدام LC-MS / MS ، قم بتحليل جميع الكسور البالغ عددها 80 للحصول على تغطية بروتيوم عميقة للغاية.

أولا ، قم بتعبئة راتنج C18 1.9 ميكرومتر في أعمدة فارغة بقطر داخلي 75 ميكرومتر يصل حجمها إلى حوالي 1.3 ميكرولتر. قم بلف العمود مرتين إلى ثلاث مرات داخل سخان محفظة الفراشات لضمان تسخين الطول بالكامل. قم بلصق العمود داخل السخان مع التأكد من عدم لصق مستشعر درجة حرارة السخان.

ثم سخني العمود إلى 65 درجة مئوية. قم بتشغيل 100 نانوغرام من ببتيدات دماغ الفئران من خلال نظام LC-MS / MS لتقييم جودة النظام. كرر هذا التقييم مرة إضافية.

بعد ذلك ، قم بتحميل ما يقرب من 0.2 ميكروغرام من الببتيدات المعاد تكوينها على العمود أثناء تدفق 5٪ من المخزن المؤقت A.قم بإزالة الببتيدات من العمود وتحليلها باستخدام مطياف الكتلة كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة إنتاجية عالية لتقدير كمية البروتينات باستراتيجية وضع العلامات متساوية الضغط 10 plex. يتم فحص كفاءة وضع العلامات على TMT باستخدام LC-MS / MS لتحليل العينات المسماة TMT والعينات المقابلة غير المسماة.

كما يتضح ، تم العثور على ذروة الببتيد غير المسمى فقط في العينة غير المسماة بينما توجد ذروة الببتيد المسمى TMT فقط في العينة المصنفة. بعد ذلك ، يتم تقييم تأثير نافذة عزل MS2 على التداخل. يتم تعيين جميع عمليات فحص MS2 إما كفحص نظيف أو صاخب.

في حين أن عمليات المسح النظيفة تظهر أيونات y1 من اليسين فقط ، فإن عمليات المسح الصاخبة تعرضها في كل من اليسين والأرجينين. يتم هنا عرض إزالة التداخل التمثيلي باستخدام ببتيدات الإشريكية القولونية المصنفة بشكل فردي بثلاثة كواشف TMT مختلفة. تكشف الشدة النسبية المجمعة أن التصحيح القائم على أيونات y1 أكثر دقة للقياس الكمي المستند إلى TMT.

بمجرد إتقانه ، يمكن إكمال هذا البروتوكول في غضون أربعة إلى خمسة أسابيع إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا التأكد من تنفيذ جميع خطوات مراقبة الجودة بالكامل لضمان دقة مجموعة البيانات النهائية قدر الإمكان. يمكن أن يؤدي تكييف هذا الإجراء للتركيز على التعديلات اللاحقة للترجمة إلى إجابة أسئلة أخرى مثل كيفية تغير الانتشار في كل مكان أو الفسفرة أو الأستلة استجابة لتطور المرض أو العلاج الدوائي.

بعد تطويرها ، مهدت التكنولوجيا الطريق للباحثين في مجال المنتجات لاستكشاف التغيرات البروتينية في الخلايا والأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية تحديد وتحديد أكثر من 10000 بروتين من خلية أو أنسجة الثدييات وتحديدها بدقة. لا تنس أن العمل مع UPLC عالي الضغط وعدد قليل من أعمدة السيليكا يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء نظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في معالجة المشكلة المعروفة المتمثلة في ضغط النسبة التي تحدث في وضع العلامات متساوية الضغط. لقد أدركنا أن التجزئة الواسعة هو طريقة رائعة ليس فقط للتخفيف من هذه المشكلة ، ولكن أيضا يزيد من تحديد البروتينات والببتيدات التي يمكن أن تزيد من تحليل البروتينات وتتكيف معه.