طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تسمية النصوص الفردية في الإشريكية القولونية لتحقيقات الحمض النووي المصنفة فلورسنت للتصور في تجارب FiSH أحادية الجزيء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأنظمة ، مثل توصيف النصوص من خلية إلى خلية قدرة مجال الاهتمام. بالإضافة إلى نصوص توطين جدار الخلية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر كمية من المعلومات حول إحصائيات عمليات النسخ. لبدء البروتوكول ، قم بزراعة الإشريكية القولونية MG1655 في وسط LB بين عشية وضحاها في شاكر مداري ، عند 260 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة الليلية عند واحد إلى 100 في وسط جديد وقياس كثافتها البصرية في مقياس الطيف الضوئي ، حتى قيمة 0.2 إلى 0.4.

بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 4 ، 500 جم عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية من جميع الأنابيب. أضف ملليلتر واحد من 1XPBS إلى كل أنبوب وأعد تعليق الحبيبات لتقليل تراكم الخلية إلى الخلية.

ثم أضف أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتثبيت وقم بدوامة الأنبوب برفق. احتضان العينات في شاكر مداري. أعد تعليق الحبيبات لتقليل التراكم من خلية إلى خلية, مما قد يتداخل مع تصوير الخلية.

بعد الحضانة ، قم بتكسير الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وأضف ملليلتر واحد من 1XPBS. نقل المعلقات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة القاع المخروطي سعة 1.8 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

ابدأ نفاذية البكتيريا عن طريق إزالة المادة الطافية بعناية. استخدم ماصات صغيرة الحجم لإزالة كل السائل خارج الحبيبات. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC.

أضف 350 ميكرولتر من الإيثانول المطلق عالي الجودة واخلط المحلول برفق عن طريق قلب الأنبوب. أضف 350 ميكرولترا أخرى من الإيثانول واخلطها مرة أخرى. ثم قم بتدوير العينة باستخدام محور دوار الأنبوب عند 20 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بيليه الخلايا من النفاذية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية. أضف ملليلتر واحد من 20٪ مخزن غسيل إلى العينات.

اتركهم واقفين لعدة دقائق. بعد ذلك ، خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة سبع دقائق عند 750 جم وأربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية برفق شديد واستخدم ماصات صغيرة الحجم لإزالة كل السائل خارج الحبيبات.

ثم أضف محلول مخزون مجموعة مسبار قليل النوكليوتيدات إلى المخزن المؤقت للتهجين بحيث يكون التركيز النهائي للقليل النوكليوتيدات 250 نانومولار ودوامة الأنبوب بقوة. قم بتعليق العينات في 50 ميكرولترا من مخزن التهجين الذي يحتوي على مجسات قليل النوكليوتيدات ، مع تجنب تكوين الفقاعات. اترك العينات طوال الليل ، في الظلام ، على كتلة حرارية عند 30 درجة مئوية.

لتحضير الغسيل ، احصل على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد لكل عينة للتصوير. أضف مخزن غسيل مليلتر واحد لكل أنبوب. أضف 10 إلى 15 ميكرولترا من العينات المهجنة إلى الأنبوب الجديد الذي يحتوي على مخزن الغسيل.

بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم قم بإزالة المادة الطافية. اغسل العينات مرتين أخريين.

أعد تعليق الحبيبات في 25 ميكرولتر المخزن المؤقت للغسيل. قم بإعداد جل الاغاروز عن طريق إضافة 150 ملليغرام من الاغاروز إلى 10 ملليلتر من 2X SSC العازلة. ضعي المحلول في الميكروويف لمدة 10 إلى 15 ثانية في كل مرة ، حتى يذوب الاغاروز تماما.

ثم اترك الأنبوب جانبا ليبرد لبضع دقائق. بعد ذلك ، ضع إطارا منفصلا من السيليكون على الشريحة بحيث يظل مركز الشريحة مكشوفا. ضع حلقة صلبة بعرض 10 ملم ، بسمك واحد إلى ملليمترين في وسط الشريحة.

ضع كمية صغيرة من الجل في المنتصف لإغلاقها وانتظر بضع دقائق حتى يتماسك الجل. ثم أضف المزيد من الجل ، حتى يتم تشكيل شكل قبة عالية. انتظر حوالي 10 دقائق حتى يتماسك الجل ويزيل الحلقة.

ضع 10 ميكرولترات من الخلايا البكتيرية المغسولة على الجل وأغلقها بشريحة انزلاق غطاء صفري. احتفظ بالعينة في الظلام لمنع تبييض الصور. تظهر قياسات smFiSH لخلايا الإشريكية القولونية مستوى تحريض galK استجابة لتركيزات D-fucose المتغيرة خارج الخلية.

يتم عرض إشارة الخلفية بواسطة سلالة محذوفة galK ، أو delta galK JW0740 كعنصر تحكم سلبي. تظهر العديد من البقع في معظم الخلايا. يتوافق مع نسخ galK مفردة أو قليلة عند إضافة اثنين من مليموللار D-fucose إلى الثقافة البكتيرية.

في حين أن بعض البقع تظهر في حالة عدم وجود D-fucose خارج الخلية. مثال آخر لتطبيق هذا البروتوكول يتم توفيره بواسطة جين sodB ، مع صور مضان وتباين طور smFiSH في نوع بري أو سلالة محذوفة JW1648 sodB. يمكن أيضا تصوير العينات المحضرة باستخدام هذا البروتوكول باستخدام STORM الذي يسمح بالدقة الدقيقة للنصوص في الخلية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأنظمة لاستكشاف إحصائيات أحداث النسخ في الخلايا الفردية.