مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

يمكن لهذه الطريقة تحديد كل من عيار التطعيم البطينية الأذينية والنقية وغير المنقى وتقييم قدرة AAV AAP على تعزيز تجميع النمط المصلي AV المماثل وغير المتجانس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة مباشرة وغير مكلفة تتجنب عيوب طرق المعايرة بالتحليل الحجمي AAV الأخرى. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم استخدامها بشكل شائع لقياس كمية نواقل AAV ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها لمعالجة العديد من الأسئلة الأساسية حول بيولوجيا AAV كما هو موضح في هذا البروتوكول.

في اليوم صفر ، بعد زراعة خلايا HEK 293 إلى 90٪ من التقاء ، قم بإعداد كاشف التعدي عن طريق خلط البلازميدات في 96 ميكرولتر من PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 مل. كما هو موضح في هذا الجدول ، فإن الكمية الإجمالية للحمض النووي هي ميكروغرامين لكل بئر. أضف أربعة ميكرولترات من محلول PEI إلى مزيج الحمض النووي البلازميد PBS.

الحجم النهائي حوالي 100 ميكرولتر أو 5٪ من حجم وسط الاستزراع. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة واحتضان خليط الحمض النووي PEI في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير لتجميع السائل إلى القاع.

وأضف خليط الحمض النووي PEI إلى وسط الاستزراع في كل بئر من لوحة ثقافة HEK 293. ثم قم بتقليب الألواح برفق وإعادتها إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. يعد تعداء خلية HEK 293 مكونا مهما في هذا البروتوكول لإنتاج الفيروسات عالية العيار.

يجب استخدام خلايا صحية ذات عدد منخفض التمرير ويجب توخي الحذر حتى لا تعطل الطبقة الأحادية للخلايا. في اليومين الأول والثاني ، تحت المجهر الفلوري المقلوب ، راقب الخلايا المنقولة باستخدام بلازميد PCMVGFP لتقييم كفاءة التعدين. في اليوم الخامس، قم بعمل ماصة الخلايا والوسط المحتوي على الفيروسات لأعلى ولأسفل أو استخدم مكشطة خلوية لكشط جميع الخلايا.

ثم انقل التعليق إلى أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين سعة 15 مل. قم بتخزين العينات على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. لاستعادة الجزيئات الفيروسية ، قم بإذابة الأنابيب المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بدوامة الأنابيب بقوة لمدة دقيقة واحدة لتعظيم استعادة AAV من الخلايا. حبيبات حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 3 ، 700 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم انقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مصنفة بأغطية لولبية لمقايسة اللطخة النقطية.

لمعالجة العينات باستخدام نوكلياز داخلي Serratia marcescens ، قم بإعداد مزيج A وخلط الكواشف B. أضف 10 ميكرولتر من كل كاشف إلى كل أنبوب عينة. قم بتدوير العينات لمدة خمس ثوان وقم بتدويرها لفترة وجيزة لجمع السائل إلى قاع الأنابيب.

ثم احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد تدوير العينات لفترة وجيزة ، قم بإجراء علاج البروتيناز K عن طريق تحضير كاشف المزيج C وإضافة 180 ميكرولتر إلى كل أنبوب. ثم بعد الدوامة وتدوير الأنابيب لفترة وجيزة مرة أخرى ، احتضنها عند 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بمجرد عودة العينات إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 200 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم وقم بدوامة الأنابيب لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بتدوير العينات في جهاز طرد مركزي دقيق عند 16 ، 100 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. انقل 320 ميكرولتر من الطبقة المائية أو 80٪ من حجم السائل المائي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق قياسي جديد.

تعتبر خطوة النقل هذه مهمة للغاية حيث يجب أخذ نفس الحجم من العينة للحفاظ على دقة القياس الكمي AAV. يجب توخي الحذر لتجنب المرحلة العضوية أثناء إزالة الطبقة المائية. قم بإعداد كاشف المزيج D وأضف 833 ميكرولتر إلى كل أنبوب عينة.

بعد دوامة الأنابيب ، احتضنها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية وامسح الأنابيب مرة واحدة على منشفة ورقية نظيفة. الماصة ما يقرب من 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول في كل أنبوب ودوامة الأنابيب لمدة خمس ثوان.

بعد تدوير العينات مرة أخرى ، اسكب المادة الطافية وامسح الأنابيب مرة واحدة على منشفة ورقية نظيفة. ثم جفف الكريات عند 65 درجة مئوية قبل تعليقها في المخزن المؤقت TE. لإجراء فحص اللطخة النقطية ، قم بإعداد معايير الحمض النووي البلازميد عن طريق تخفيف الحمض النووي البلازميد الجينوم المتجه AAV إلى 10 نانوغرام لكل ميكرولتر في الماء أو مخزن Tris-HCL.

انقل كمية 25 ميكرولترا من الحمض النووي البلازميد المخفف إلى أنبوب جديد وقم بخطها بإنزيم تقييد مناسب في حجم تفاعل 50 ميكرولتر لمدة ساعة واحدة. أضف 450 ميكرولتر من الماء أو TE إلى الأنبوب الذي يحتوي على معيار الحمض النووي البلازميد المهضوم واخلطه جيدا. ثم انقل 70 ميكرولترا من هذا الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر مع 1،330 ميكرولتر من الماء أو TE لعمل معيار بلازميد مخفف.

لإعداد جهاز اللطخة النقطية ، باستخدام المقص ، قم بقص غشاء النشاف إلى حجم مناسب لعدد العينات والمعايير. انقع الغشاء بالماء لمدة 10 دقائق قبل وضعه على جهاز اللطخة النقطية. ثم قم بتغطية الآبار غير المستخدمة.

أضف الماء إلى الآبار التي سيتم تحميل العينات عليها. ضع مكنسة كهربائية ، واسحب الماء عبر الآبار ، وتحقق من وجود أخطاء ، ثم أعد شد البراغي. أعد الاختبار إذا لزم الأمر.

ضع 400 ميكرولتر من كل معيار بلازميد مخفف للحمض النووي على كل بئر وقم بتشغيل أربعة ممرات من التخفيفات القياسية. استخدم حصتين منفصلتين من الملخص القياسي وقم بتحميل كل منهما في نسختين. ثم ضع 200 ميكرولتر لكل بئر من كل عينة من الحمض النووي الفيروسي.

ضع مكنسة كهربائية لطيفة لسحب محاليل الحمض النووي عبر الآبار. ثم بمجرد إفراغ جميع الآبار ، حرر الفراغ عن طريق ضبط الصمام ثلاثي الاتجاهات. أضف 400 ميكرولتر من محلول قلوي X واحد لكل بئر.

ثم انتظر لمدة خمس دقائق قبل إعادة تطبيق الفراغ لتفريغ الآبار. أعد تطبيق الفراغ وتفكيك جهاز اللطخة النقطية. ثم قم بإزالة الغشاء وشطفه باثنين من X SSC.

ضع الغشاء على منشفة ورقية نظيفة بحيث يكون الجانب المرتبط بالحمض النووي متجها لأعلى لإزالة المخزن المؤقت الزائد. استخدم أداة تشابك مناسبة للأشعة فوق البنفسجية لربط الحمض النووي الملطخ بالغشاء بالأشعة فوق البنفسجية. الغشاء جاهز الآن للتهجين.

ضع الغشاء في زجاجة تهجين مع الجانب المرتبط بالحمض النووي لأعلى. اشطف الغشاء بخمسة إلى 10 ملليلتر من مخزن التهجين الدافئ مسبقا وتخلص من المخزن المؤقت. ثم أضف 10 مل من مخزن التهجين الدافئ مسبقا وضع الزجاجة في فرن تهجين دوار مضبوطة على 65 درجة مئوية.

قم بتدوير الزجاجة لمدة خمس دقائق على الأقل. أضف الحمض النووي للحيوانات المنوية المشعة والمسبار المشع بسرعة إلى مخزن التهجين في الزجاجة ورجها لمدة 10 ثوان حتى تمتزج. أعد الزجاجة إلى فرن 65 درجة مئوية واحتضنها بالتناوب عند 65 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل.

بمجرد اكتمال التهجين ، أوقف الدوران. قم بإزالة زجاجة التهجين ثم صب محلول المسبار المشع في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مع غطاء مانع للتسرب من السدادة. لغسل الغشاء ، أضف 20 إلى 30 ميكرولترا من مخزن الغسيل المخزن المؤقت الدافئ مسبقا إلى زجاجة التهجين وقم بتدويرها لمدة خمس دقائق.

كرر هذا الغسيل مرتين أخريين. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة الغشاء من زجاجة التهجين ، وباستخدام المناشف الورقية ، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الغشاء. ثم ضع الغشاء في حامل ورق بلاستيكي شفاف.

باستخدام عداد جيجر ، تحقق من الإشارات المشعة على الغشاء. بعد تعريض شاشة التصوير الفوسفوري المحذوفة للغشاء ، قم بمسح الشاشة باستخدام نظام مسح الصور الفوسفورية واحصل على البيانات المتعلقة بكثافة الإشارة لكل نقطة. إجراء تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.

تحتوي هذه اللطخة النقطية الكمية لمعايرة متجهات AAV 2G9 على مجموعتين من المعايير وثلاثة كميات مختلفة من مستحضر ناقل AAV ، بما في ذلك 0.3 و 0.1 و 0.03 ميكرولتر في نسختين. يتم تحديد المبالغ التي سيتم فحصها على اللطخة تجريبيا أو بناء على فحص أولي. تم تحديد الاستيفاء من خلال الاستيفاء أن 0.3 و 0.1 و 0.03 ميكرولتر من متجه AAV 2G9 كان لها في المتوسط عيار 5.16 و 0.27 نانوجرام ميكرولتر مكافئ.

تم تقييم جميع مجموعات النمط المصلي المماثلة وغير المتجانسة الممكنة لبروتينات VP3 cas-pid و AAP من AAV5 و AAV9 و Snake AAV لتجميع القفيصة عن طريق مقايسة لطخة النقاط الكمية. تظهر نتائج هذا الرسم البياني أن AAV5 VP3 يتجمع بغض النظر عما إذا كان AAP قد تم توفيره في العابر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل AAP5 و AAP9 تعزيز تجميع قفيصة AAV9 VP3 ، على الرغم من أن AAP5 يعمل بشكل أقل فعالية من AAP9.

لا يعرض AAP5 ولا AAP9 تجميعا نشاطا يروج لنشاط الثعبان AAV VP3 ، ويعزز الثعبان AAP فقط تجميع الثعبان AAV VP3. تم تطبيق تحليل اللطخة النقطية لتقييم نشاط النوكلياز لثلاثة نوكليازات متاحة تجاريا في ظل ظروف غير محسنة تحتوي على شوائب مشتقة من الخلية والاستزراع. تم العثور على الإنزيم A ليس نشطا مثل الإنزيمين الآخرين ، مما يدل على أن اختيار النوكلياز يمكن أن يؤثر بشكل كبير على قراءة مقايسة اللطخة النقطية.

هذه التقنية واضحة ومباشرة لتقدير كمية ناقلات AAV ومفيدة في تقييم دور AAP في تعزيز تجميع قفيصة AAV المشتقة من الأنماط المصلية المتشابهة وغير المتجانسة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في يوم واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بمجرد الحصول على عينات الفحص في تجارب زراعة الخلايا. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تضع الماصة بعناية لحجم السائل الصحيح لضمان الدقة الكمية.

بعد تطويره ، مهد تطبيق مقايسة اللطخة النقطية الكمية لدراسة AAP الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا AAV لفهم آلية تجميع القفيصة AAV. من فضلك لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية والعوامل الفيروسية والفينول كلوروفورم والمواد المشعة يمكن أن يكون خطيرا للغاية. وهناك حاجة إلى استخدام معاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية للحد من التعرض.

يجب التعامل مع هذه المواد فقط في المناطق المعتمدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات اللطخة النقطية لقياس كمية AAV ، وإعداد جهاز اللطخة النقطية ، وتحديد عيار AAV ، وتطبيق الإجراء على دراسة بيولوجيا AAV. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات أخرى مثل فحوصات نقل ناقل AAV في خلايا المزرعة للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل العيار الوظيفي للمتجه مقارنة بعيار الجسيمات الفيزيائية الذي يحدده مقايسة اللطخة النقطية.