مقايسة بسيطة ومنخفضة التكلفة لقياس أمبوليشن في نماذج الماوس من ضمور العضلات
ديسمبر 29, 2017
ويصف هذا البروتوكول نظام مرن، ومنخفضة التكلفة لقياس أمبوليشن الفأرة في مقايسة نشاط حقل مفتوح. نظهر أن مقايسة أمبولاتيون 6 دقائق استناداً إلى هذا النظام يكشف عن انخفاض في الحركة الطوعية في الفئران mdx ، ويميز بدقة التحسين في إنقاذ الخاصة بالعضلات لهذه الحيوانات.
الهدف العام من هذا المقايسة هو قياس المشي الطوعي في نماذج الفئران المصابة بضمور العضلات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال ضمور العضلات حول تطور ضعف العضلات في نماذج الفئران المصابة بضمور العضلات، ومدى فعالية العلاجات المحتملة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر قياساً غير جراحي وقابلاً للتكرار لنشاط الحيوان، ويمكن تكييفها بسهولة مع العديد من سياقات البحث المختلفة.
في غرفة هادئة ذات درجة حرارة مضبوطة وفي وقت ثابت من اليوم، ضع كاميرا على شبكة سلكية فوق غرفة النشاط للسماح بالتسجيل في كامل الساحة، وقم بتنظيف الغرفة باستخدام مطهر. وقبل البدء مباشرة في تسجيل النشاط، اسمح للفأر بالإمساك بقضيب السحب الخاص بمقياس قوة رقمي، ثم اسحب للخلف بلطف حتى يتحرر قضيب السحب. سجل ذروة الشد بوحدة Newtons لكل تجربة.
مع فترة راحة لمدة دقيقة واحدة بين التجارب. مباشرة بعد اختبار قوة القبضة، ضع الفأر في الغرفة وابدأ تسجيل الفيديو، مع السماح للفأر بالاستكشاف بحرية. بعد ست دقائق، أوقف التسجيل، وأعِد الفأر إلى قفصه.
لإجراء تحليل التتبع لبيانات الفيديو، افتح التسجيل أولاً باستخدام برنامج تحرير الفيديو المناسب، واضبط السرعة على ضعفي السرعة الأصلية. قم بتصدير الفيديو المُقلص بتنسيق ملف mp4 لتحليله تتبعياً، ثم افتح الفيديو في برنامج تحليل الفيديو المناسب. ولضبط معايرة تسجيل الفيديو، استخدم أداة الخط لرسم خط على طول أحد جوانب الغرفة.
انقر بزر الماوس الأيمن على الخط، واختر معايرة القياس (calibrate measure)، ثم أدخل الحجم الفعلي لجانب الغرفة بالسنتيمتر. لبدء التتبع شبه الآلي لموضع الفأر، انقر فوق مؤشر التحريك (move cursor). وبدءًا من الإطار الأول في الفيديو، انقر بزر الماوس الأيمن على النقطة المراد تتبعها.
سيتم تمييز نقطة التتبع بدائرة زرقاء. استخدم السهم الأيمن في لوحة المفاتيح للانتقال إلى الإطار التالي. يجب أن تتحرك نقطة التتبع تلقائيًا بناءً على موضع قاعدة الذيل.
إذا لم يكن موضع التتبع محاذيًا لنقطة الاهتمام في إطار معين، فقم بمحاذاة الدائرة الزرقاء يدويًا مع موضع التتبع. وعندما يتم تتبع الفيديو بالكامل، احفظ الفيديو وطبقة التتبع المختارة، ثم اختر التصدير إلى جدول بيانات لتصدير البيانات الموضعية لعملية التتبع. وتماشياً مع النتائج المسجلة من اختبارات مماثلة، فإن فئران mdx التي تفتقر إلى البروتين dystrophin والتي خضعت لبروتوكول تمارين رياضية مباشرة قبل الاختبار، تظهر حركة تطوعية أقل بكثير في اختبار المجال المفتوح لمدة ست دقائق، مقارنة بالحيوانات من النوع البري.
وبالفعل، عقب بذل جهد خفيف في اختبار قوة القبضة، ظلت الفئران من سلالة mdx عادةً ساكنة خلال الدقائق القليلة الأولى من بروتوكول المشي، مع زيادة طفيفة في الحركة بحلول الدقيقة الرابعة أو الخامسة. ومع ذلك، عند مقارنة الحيوانات من النوع البري (wild type) وحيوانات mdx دون تعريضها لاختبار الجهد، لم يتم رصد أي اختلافات في المسافة المقطوعة. أما فئران mdx المعدلة وراثياً للتعبير عن البروتين utrophin، فقد كانت غير قابلة للتمييز عن الحيوانات من النوع البري، حيث لم تظهر أي فروق ذات دلالة إحصائية في إجمالي المسافة المقطوعة، أو في أي من النقاط الزمنية التراكمية المرصودة.
لتحديد تأثير خفض معدل أخذ العينات، تم قياس إجمالي المسافة المقطوعة من دقيقة واحدة من فيديو بمعدل إطارات كامل، ومقارنتها بقياسات المسافة المستمدة من نسخ منخفضة العينات من مجموعة البيانات. وقد أدى تقليل معدل الإطارات إلى النصف إلى خفض المسافة المقاسة بنسبة 5% من المسافة الأصلية المحسوبة. وتنخفض دقة المسافة المقاسة بشكل حاد بعد هذه النقطة، على الرغم من أن مجموعات البيانات التي خضعت لعمليات تقليل كبيرة لا تزال تقارب بدقة مسار الحيوان، مما يسلط الضوء على أهمية مراعاة معدل الإطارات ومعالجة الإشارات عند تقييم نشاط الحيوان، ويثبت أنه يمكن الحفاظ على دقة مكانية عالية في بيانات الفيديو منخفضة العينات.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تسجيل وتحليل حركة الفأر في بيئة المجال المفتوح. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمام هذا التحليل في غضون 15 إلى 30 دقيقة إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. يسمح هذا الاختبار منخفض التكلفة وغير الجراحي للباحثين بفحص النشاط الحركي في نماذج الفئران المصابة بضمور العضلات، ويمكن أن يكون بمثابة خطوة أولى مفيدة لإجراء قياسات وظيفية إضافية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول نظاماً مرناً ومنخفض التكلفة لقياس حركة الفأر في اختبار النشاط في الحقل المفتوح. توفر هذه الطريقة قياساً غير باضع وقابلاً للتكرار لنشاط الحيوان، ويمكن تكييفها مع مختلف إعدادات البحث.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- أبحاث الحثل العضلي
- التحليل السلوكي
خلفية علمية
- يقيس هذا الاختبار المشي الطوعي في نماذج الفئران المصابة بضمور العضلات.
- ويتناول الأسئلة الرئيسية المتعلقة بتطور ضعف العضلات.
- صُممت هذه التقنية لتقييم فعالية العلاجات المحتملة.
- يتم التسجيل في بيئة خاضعة للرقابة لضمان الاتساق.
الغرض من الدراسة
- لقياس الحركة الإرادية في فئران mdx.
- لتقييم تأثير التدخلات الخاصة بالعضلات.
- لتوفير رؤى حول تطور الحثل العضلي.
الطرق المستخدمة
- استخدام كاميرا مثبتة فوق غرفة النشاط لأغراض التسجيل.
- تنظيف الغرفة بمطهر قبل البدء بالتجارب.
- السماح للفأر بالإمساك بقضيب عمودي لقياس ذروة الشد.
- تسجيل النشاط خلال اختبار حركة يستمر لمدة 6 دقائق.
النتائج الرئيسية
- يكتشف النظام انخفاضات في الحركة التطوعية لدى فئران mdx.
- يميز النظام بدقة التحسنات الناتجة عن الإنقاذ النوعي للعضلات.
- النتائج قابلة للتكرار عبر تجارب مختلفة.
- تتميز هذه الطريقة بقابليتها للتكيف مع مختلف إعدادات البحث.
الاستنتاجات
- تُعد هذه المقايسة فعالة لدراسة الحثل العضلي في الفئران.
- توفر هذه الطريقة بيانات قيمة حول فعالية العلاجات المحتملة.
- يتميز هذا النهج بالمرونة ويمكن استخدامه في بيئات بحثية متنوعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يوفر قياس المشي التطوعي في نماذج الفئران قراءة ترجمية للوظيفة الحركية في الحثل العضلي، وهو ما يماثل مباشرةً النقاط النهائية السريرية مثل اختبار المشي لمدة 6 دقائق. يتيح هذا المقايسة القائمة على الفيديو ومنخفضة التكلفة تقييماً غير باضع وقابلاً للتكرار لتطور المرض والاستجابة العلاجية في الدراسات قبل السريرية. ومن خلال الكشف عن عجز النشاط في فئران mdx التي تفتقر إلى dystrophin والإنقاذ عبر تعبير utrophin، تدعم هذه الطريقة التحقق من الهدف وتقليل المخاطر الآلية في اكتشاف أدوية الأمراض العصبية العضلية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: اختبار الفرضيات العلاجية عن طريق قياس المشي الطوعي كقراءة وظيفية لقوة العضلات في النماذج الضمورية.
- القيمة التشغيلية: تمكين تقليل المخاطر البيولوجية من خلال ارتباط قابل للتكرار بين النمط الجيني والنمط الظاهري في فئران mdx مقارنة بمجموعات النوع البري والمجموعات التي تم إنقاذها.
- القيمة التنبؤية: دعم فرز محفظة المشاريع من خلال تمييز التدخلات الفعالة (مثل transgene utrophin) التي تعيد مستويات النشاط إلى طبيعتها كما في النوع البري.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تجهيز أنظمة بيولوجية مصادق عليها لفحص المركبات في المراحل اللاحقة باستخدام مقاييس قياسية للمشي في مجال مفتوح.
- القابلية للتكرار: تقديم مخرجات كمية تعتمد على المسافة والزمن، مما يسهل توحيد المقايسة عبر المختبرات المختلفة.
- القابلية للتوسع: الاستفادة من برمجيات مجانية ومفتوحة المصدر وأجهزة ميسورة التكلفة لتمكين إعادة استخدام المنصة في بيئات بحثية متنوعة دون الحاجة إلى معدات متخصصة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: يحاكي قصور القدرة على المشي ذو الصلة بالمريض، مما يوفر استمرارية ترجمية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يوضح ما إذا كانت التأثيرات الملحوظة ناتجة عن إنقاذ خاص بالعضلات مقابل تغيرات غير محددة في النشاط.
- قرارات معدلة حسب المخاطر: يوجه معايير اتخاذ قرار الاستمرار أو التوقف من خلال ربط استعادة القدرة على المشي بالارتباط بالهدف وتعديل المسار.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يندرج هذا المقايسة ضمن سلسلة الاكتشاف الممتدة من التحقق من الهدف إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر جسراً وظيفياً يربط بين الآليات الجزيئية والنتائج المظهرية في نماذج الحثل العضلي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال ربط التدخلات الجينية أو الدوائية بالتغيرات القابلة للقياس في الحركة الإرادية.
- المسح: تتيح جاهزية المقايسة من خلال تتبع قائم على الفيديو وقابل للتكرار، مما يولد نقاط نهاية كمية للمشي لتقييم المركبات.
- التحليلات: تولد تدفقات من البيانات الموضعية والزمنية التي تسمح للفرق بمقارنة النشاط الحركي عبر الأنماط الجينية، والمعالجات، والنقاط الزمنية.
- الأبحاث الانتقالية: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال محاكاة تقييمات المشي السريرية، مما يسهل مواءمة المؤشرات الحيوية والنمذجة التنبؤية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس قدرة منخفضة التكلفة وقابلة لإعادة الاستخدام لاختبار المشي، مما يقلل الاعتماد على المرافق المركزية المتخصصة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في فحوصات الوظيفة الحركية.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال التتبع مفتوح المصدر والظروف البيئية المضبطة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال عن طريق إلغاء الحاجة إلى أنظمة تتبع الحركة الباهظة مع الحفاظ على جودة البيانات.
- التأثير على المحفظة: تتيح اتخاذ قرارات تقدم مدروسة بناءً على المخاطر استناداً إلى الإنقاذ الوظيفي للنماذج المظهرية للمشي في النماذج قبل السريرية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة أساسية في تسجيل الفيديو وبرمجيات التتبع مفتوحة المصدر (على سبيل المثال، المحاذاة اليدوية إطاراً بإطار).
- يعتمد على معدات تصوير قياسية وضوابط بيئية ثابتة (الإضاءة، ودرجة الحرارة، ووقت اليوم).
- يستلزم الالتزام بالبروتوكول من قبل جميع الفرق لضمان قابلية تكرار النتائج عبر المواقع والمشغلين المختلفين.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع أحجام الغرف المختلفة، وسلالات الفئران، ومستويات النشاط.
- يتضمن مفاضلات بين معدل الإطارات ودقة القياس، حيث يقلل خفض عينات البيانات من الدقة في حساب المسافة.
