الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

يتمثل الهدف العام من الوظيفة الكيميائية لسطح جسيمات HEV النانوية في توفير نهج قابل للتكرار ومتسق لاقتران الجزيئات المناعية العلاجية والتشخيصية المستهدفة بسطح جسيمات HEV النانوية لأغراض التشخيص والعلاج.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الطب النانوي، مثل كيفية مراقبة تعزيز استهداف السرطان وتوزيع العلاجات النانوية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها عالية القابلية للتكرار، وفعالة، وأسهل بكثير في التنفيذ مقارنةً بالهندسة الوراثية.

سيقوم بشرح الإجراءات كل من ميشيل نغوين وإيفان رويز، وهما مساعدان بحثيان من مختبرنا.

ابدأ هذا البروتوكول بإنتاج وتنقية جسيمات فيروس التهاب الكبد E النانوية كما هو موضح في البروتوكول النصي.

قم بتخفيف عينات جسيمات HEV النانوية لتصبح بتركيز يتراوح بين 0.5 و2 mg/mL باستخدام 10 mM من MES، pH 6.2 من أجل التصوير بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM). قم بتأيين الشبكات المطلية بالكربون باستخدام تفريغ توهجي بقدر 40 mA لمدة 30 ثانية لإنتاج سطح كربوني محب للماء. يمكن أن يستمر السطح الكربوني المحب للماء للشبكات لمدة 30 دقيقة فقط بعد معالجة التفريغ التوهجي. بعد التأيين، أمسك الشبكة والملقط وأضف 2 µL من عينة جسيمات HEV النانوية إلى الشبكة.

بعد 15 إلى 30 ثانية، جفف الشبكة باستخدام ورق ترشيح. ثم اغسل الشبكة فوراً بالماء المقطر المزدوج وجففها مرة أخرى بورق الترشيح. أضف فوراً 2 µL من أسيتات اليورانيل بتركيز 2% إلى الشبكة. بعد 15 ثانية، جفف الشبكة باستخدام ورق ترشيح. جفف شبكات العينات بوضعها في خزانة تجفيف إلكترونية مزيلة للرطوبة طوال الليل.

اعتماداً على العينة، قد يكون المجهر الإلكتروني المبرد أو cryo-EM ضرورياً لتصور البنية وتوصيفها. انقل الشبكة إلى TEM وقم بالتصوير بتكبير يتراوح من 10 إلى 80K. تظهر جسيمات HEV النانوية في TEM كبروتينات عشرونية الوجوه فارغة يبلغ قطرها حوالي 27 nanometers بسبب غياب الـ RNA الفيروسي.

لإجراء عملية الربط أحادية الخطوة لجسيمات HEV النانوية مع البيوتين المرتبط بالماليميد، ابدأ بتطبيق جسيمات HEV النانوية في وحدات دياليز صغيرة. قم بإجراء الدياليز للجسيمات النانوية مقابل محلول PBS بتركيز 0.01 مولاري وبدرجة حموضة pH 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد الدياليز، انقل جسيمات HEV النانوية إلى أنابيب سعة 1.5 ميليلتر وقم بقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي. اخلط الجسيمات النانوية بتركيز 1 ميليجرام لكل ميليلتر مع كمية مساوية من الماليميد-بيوتين بتركيز 100 ميكرومولار ومحلول PBS بتركيز 0.01 مولاري وبدرجة حموضة pH 7.4 لتحقيق نسبة مولية من 1 إلى 5. بعد ترك التفاعل طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، قم بإزالة الماليميد-بيوتين غير المرتبط باستخدام إجراء عمود إزالة الأملاح الطرد مركزي وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. حلل العينات من خلال تقنية SDS page المختزلة القياسية.

باستخدام الإجراءات القياسية، قم بإعداد تحليل لطخة وسترن Chemiluminescent Western blot باستخدام ستريبتاديفين مرتبطة بـ HRP، ثم التقط الإشارة الكيميائية المضيئة بواسطة فيلم الأشعة السينية X-ray film.

لإجراء عملية اقتران من خطوتين للرابط النوعي لخلايا سرطان الثدي، LXY30، مع السيستين المكشوف على سطح جسيمات HEV النانوية، ضع الجسيمات النانوية أولاً في وحدات دياليز صغيرة وقم بإجراء الدياليز مقابل محلول PBS بتركيز 0.01 مولار وبدرجة حموضة pH 7.4 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، انقل جسيمات HEV النانوية إلى أنابيب سعة 1.5 ملليمتر وقم بقياس تركيز البروتين عند 280 نانومتر باستخدام جهاز مطياف الامتصاصي. بعد ذلك، اخلط 650 ميكرومولار من maleimide-azide و 650 ميكرومولار من alkyne-LXY30 مع 200 ميكرومولار من كبريتات النحاس ومليمولار واحد من حمض الأسكوربيك. يؤدي ذلك إلى تكوين maleimide-linked-LXY-30 بتركيز 650 ميكرومولار. قم بحضن الخليط عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، اخلط جسيمات HEV النانوية بتركيز مليمجرام واحد لكل ملليمتر مع حوالي 10% من حجم maleimide-linked LXY30 لتحقيق نسبة مولارية من 1 إلى 3. اترك التفاعل يحدث طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وبسبب التركيز العالي نسبياً لـ maleimide LXY30، تنخفض التركيزات النهائية للمتفاعلات مثل كبريتات النحاس بمقدار 10 مرات تقريباً بعد الخلط. ولتجنب تضرر جسيمات فيروس التهاب الكبد E النانوية، يمكن استخدام طريقة الاقتران الخالية من النحاس كخيار بديل.

قم بإزالة maleimide click LXY30 غير المرتبط باستخدام عمود إزالة الملح بالدوران وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. احفظ جسيمات HEV النانوية المرتبطة بـ LXY30 عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية. لإجراء اقتران خطوة واحدة لجسيمات LXY30 HEV النانوية ووسم Cy5.5 الفلوري، قم أولاً بخلط الجسيمات النانوية المرتبطة بـ LXY30 بتركيز 1 mg/mL مع حجم مساوٍ من وسم Cy5.5 الفلوري لتحقيق نسبة مولارية من 1 إلى 5. بعد مفاعلة الخليط طوال الليل عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية، قم بإزالة Cy5.5 NHS غير المرتبط باستخدام إجراء عمود إزالة الملح بالدوران وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. احفظ جسيمات HEV النانوية المرتبطة بـ LXY30 Cy5.5 عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.

تم اختبار طريقتين لتوظيف LXY30 في وظيفية جسيمات HEV النانوية لاستهداف الخلايا الورمية. عندما رُبطت جسيمات HEV 573C النانوية بـ maleimide azide أولاً، ثم تلا ذلك تفاعل كيمياء النقر (click chemistry) مع LXY30 alkyne، بدت جسيمات HEV 573C النانوية وكأنها تفككت تحت ملاحظة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). ومع ذلك، فإن إجراء تفاعل كيمياء النقر أولاً بين LXY30-alkyne وmaleimide-azide لتكوين LXY30 مرتبط بـ maleimide، متبوعاً بالاقتران لجسيمات HEV النانوية المعدلة، لم يؤثر على بنيتها وبقيت جسيمات HEV 573C النانوية سليمة. تم تطبيق جسيمات HEV النانوية المرتبطة بـ LXY30 وCy5.5 على خلايا سرطان الثدي المستنبتة وفحصها بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy). وتشير صور الفلورة بالأشعة تحت الحمراء القريبة بواسطة المجهر البؤري إلى أن جسيمات HEV النانوية المرتبطة بـ LXY30 Cy5.5 تمتلك ألفة ارتباط أعلى، مما أدى إلى زيادة الاستيعاب الداخلي في خلايا سرطان الثدي MDA MB-231 مقارنة بجسيمات HEV النانوية المرتبطة بـ Cy5.5 فقط.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو فحص الجزيئات العلاجية وأهداف الاستهداف متعدد الوسائط، والتي تسمح باستهداف وتشخيص دقيق للأورام دون التسبب في تلف الخلايا الطبيعية. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول السرطان واستهداف الأورام من خلال تعديل السطح كيميائيًا، إلا أنه يمكن تطبيقها في التشخيص المبكر للسرطان، والفحص، والعلاج الموجه بالتصوير.