كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف التفاعلات الحساسة للمنظفات بين بروتينات الغشاء أو البروتينات الأخرى. يتطلب هذا الإجراء أن يتم تمييز أحد البروتينات بالهيستيدين والتعبير عنه أكثر من اللازم في الخلايا ، بينما الآخر عبارة عن ببتيد يحمل علامة myc. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال في مجال دراسات تفاعل البروتين المهمة في مجال الكيمياء الحيوية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على اكتشاف التفاعل بين بروتينات الغشاء بطريقة حساسة للمنظفات. الإجراء سريع وسهل. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتفاعلات البروتين الغشائي ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة تفاعلات البروتين الضعيفة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا التحقق من التفاعل بين بروتينات الغشاء ، Saltilin و GLUT4 ، لكن محاولات ترسيبها المناعي المشترك من تحلل الثدييات لا تزال غير ناجحة. لوضع طلب للببتيد ، حدد التسلسل المستهدف للببتيد الحرج للتفاعل وأضف حاتمة myc في النهاية أو الطرف C للتسلسل. بمجرد وصول الببتيد ، قم بعمل 100 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول عمل الببتيد في ماء فائق النقاء.

قم بزرع ثلاث خلايا 3T3-L1 قبل الخلايا الشحمية في أربعة أطباق استزراع 10 سم واحتفظ بها في الحاضنة. بعد ذلك ، قم بتحويل طبقين من الثقافات باستخدام البروتين المستهدف الموسوم بالهيستودين 6X وقم بتسميته على أنه HISP في الطبقين الآخرين مع اثنين من البلازميدات التحكم وتسميتها ب WT. بعد التعدي ، اترك الخلايا في الحاضنة لمدة 48 ساعة لتصل إلى 80 إلى 90٪ من التقاء. لتحضير محللة الخلية ، اغسل الخلايا على الثلج ثلاث مرات باستخدام 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن 1X مبرد أربع درجات مئوية.

ثم أضف 500 ميكرولتر من مخزن التحلل إلى كل منها. ثم افصل الخلايا عن الأطباق باستخدام مكشطة الخلية لتحضير المحللة. انقل محللة الخلية المحضرة من كل طبق استزراع إلى أربعة أنابيب منفصلة مقاس 1.5 ملم وقم بتسمية جميع الأنابيب.

بعد ذلك ، قم بتمرير محللة الخلية من خلال حقنة بإبرة قياس 26 لأعلى ولأسفل لمدة خمس مرات لتحلل الخلية بالكامل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات الخلوية عند 16000xg لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. انقل المواد الطافية إلى أربعة أنابيب جديدة ذات علامات متطابقة.

لتجارب استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحكم في المستقبل ، قم بتخزين 20 ميكرولترا من محللة الخلية وتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية. للاستخدام لاحقا ، قم بمعايرة مخزن الغسيل عند PH8 بحمض الهيدروكلوريك للحصول على PH6 وتخزين المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، لإعداد تعليق متجانس لخرز الكوبالت ، قم بتدوير الزجاجة بعناية.

بعد ذلك ، قم بنقل 40 ميكرولترا من تعليق حبة الكوبالت إلى جميع الأنابيب الأربعة التي تم تمييزها بشكل فردي. بعد إضافة حبات الكوبالت ، أضف ملليلترا واحدا من محلول التحلل إلى الأنابيب. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 1000xg لمدة خمس ثوان.

تخلص من المادة الطافية والماصة 40 ميكرولترا من محلول التحلل في الخرز المستقر. بعد ذلك ، انقل محللة الخلية إلى الأنابيب المقابلة واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة على دوار الأنبوب. بعد 90 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 1000xg لمدة خمس ثوان.

بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية المسماة Flowthrough-1 وقم بتخزينها عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل مع PH8 إلى الأنابيب الفردية وأعد تعليق الخرز برفق. الطرد المركزي الأنابيب عند 1000xg لمدة خمس ثوان وطرد المواد الطافية.

ثم أضف عازلة الغسيل مع PH8 مع أو ستة إلى الأنابيب ، وفقا للملصقات وأعد تعليق الخرز جيدا. الطرد المركزي الأنابيب عند 1000xg لمدة خمس ثوان وطرد المواد الطافية. قم بإعداد ميكروغرام واحد لكل مليلتر من محلول عمل الببتيد والماء مع PH6 أو ثمانية.

ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الببتيد إلى الخرز المغسول المقابل لدرجة الحموضة المماثلة. ثم احتضان الخرزات عند أربع درجات مئوية على أنبوب دوار لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، خذ أربعة أعمدة دقيقة ، وقم بتسميتها وضع الأعمدة في أنابيب تجميع تسمى Flowthrough-2. بعد انتهاء الحضانة ، أضف خليط الحضانة إلى الأعمدة.

دع المحلول يمر بقوة الجاذبية واجمع العينة من التدفق. ضع الأعمدة في أنابيب تجميع جديدة وقم بتخزينها على حرارة 20 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتمرير 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إما باستخدام PH6 أو ثمانية عن طريق تدفق الجاذبية عبر الأعمدة الفردية وتخلص من التدفق.

كرر هذه الخطوة أربع مرات. الطرد المركزي الأنابيب عند 1000xg لمدة خمس ثوان. ضع العمود في أنبوب التجميع الجديد المسمى Elution.

من المهم غسل الخرز في جميع الأنابيب بعناية فائقة وبشكل متساو للتخلص من الببتيد غير المرتبط. أضف إلى الخرز المغسول 40 ميكرولترا من عينة tricine مع بيتا ميركابتو إيثانول. اتركه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

الطرد المركزي العمود عند 8000xg لمدة دقيقتين. تخلص من الأعمدة وقم بتسخين أنابيب التجميع على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. وبعد ذلك ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 1000xg لمدة خمس ثوان.

بدلا من ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من محلول Elution Imidazole إلى الخرز المغسول واحتضانه في الغرفة المعتدلة لمدة 20 دقيقة. بعد انتهاء الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 8000xg لمدة دقيقتين. تخلص من الأعمدة وأضف عينة تريسين 40 ميكرولتر.

قم بتسخين أنابيب التجميع عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة خمس ثوان. استخدم المواد الهلامية المتدرجة المتوفرة تجاريا بنسبة 10-20٪. استخدم المخزن المؤقت للتشغيل Tris / Tricine / SDS ، ثم قم بتحميل 20 ميكرولترا لكل من العينات المملوءة والمحللة الكلية على الجل وابدأ في تشغيل وحدة الرحلان الكهربائي.

بمجرد انتهاء الرحلان الكهربائي ، استخدم مخزن النقل المكمل بنسبة 20٪ من الميثانول لنقل المادة من الجل إلى غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر. بعد سد الغشاء ، قم بقصه أفقيا. بعد ذلك ، قم بفحص الجزء العلوي من الغشاء باستخدام الجسم المضاد Anti His P في النصف السفلي من الغشاء باستخدام مضاد myc.

لدراسة التفاعل بين السورتيلين الثابت على حبات الكوبالت في GLUT4 ، تم إجراء تحليل اللطخة المناعية. تم الحصول على المحللات الخلوية والخلايا المشطبة من النوع البري و Sortilin-myc / His-tagged خلايا 3T3-L1 المنقولة ثم تحميلها على صفحة SDS. تم فحص اللطخة بجسم مضاد مضاد ل myc.

تظهر اللطخة 110 كيلودوتين Sortili-myc / His-tagged وخمسة كيلوتين myc-أول حلقة لمعية GLUT4 من الشطف المنقول. بعد ذلك ، لدراسة أهمية الرقم الهيدروجيني والتفاعل بين سورتيلين الثابت على حبات الكوبالت و GLUT4 ، تم إجراء تحليل اللطخة المناعية. في هذا الاختبار ، تم تحضين الحلقة اللمعية الأولى من Myc GLUT4 بخرز ثابت ببروتينات Sortilin-myc / His الموسومة في كل من PH6 وثمانية.

تظهر اللطخة تفاعلا واضحا بين Sortilin-myc / His و myc-first luminal loop GLUT4 في كل من PH6 وثمانية من الشطف الذي تم الحصول عليه من خلايا Sortilin-myc / His-Stagged 3T3-L1. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات حتى تصبح العينات جاهزة لتحليل الدم الغربي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تصميم ببتيد قابل للذوبان ، ويفضل أن يكون في الماء.

لتعزيز نتائجك ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الترسيب المناعي بعد التشابك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف البروتين الغشائي وتفاعلات البروتين في إجراء حساس للمنظفات. كما يسمح باستكشاف التفاعل بين شظايا البروتين.

موسيقى الجاز الإيقاعية الناعمة.