إجراء شامل تقييم أداء نيوفاسكولاريزيشن هيمانجيوبلاستوما المفترضة استخدام كروي تنتشر في التحليل في المختبر

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم أداء الورم الأرومي الوعائي الوعائي الافتراضي المفترض باستخدام مقايسة الإنبات الكروي في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تولد الأوعية الدموية ، مثل تكوين الأوعية الدموية للورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نتاج إجراء شامل للتقييم في المختبر حيث يوجد تكوين الأوعية الدموية الكلاسيكي للورم في الورم الأرومي الوعائي وينمو في الورم الأرومي الوعائي وينمو في الورم الأرومي الوعائي

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج الأرومة الدموية والأوعية الدموية لأن النتيجة تسلط الضوء على تعقيد الأوعية الدموية الأرومية الوعائية الجديدة ، وهذا يشير إلى أن هذا الشكل الشائع من تكوين الأوعية الدموية ليس سوى آلية تكميلية. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لدراسة الأوعية الدموية الأرومية الوعائية الجديدة. يمكن أيضا تطبيقه على الأورام وتكوين الأوعية الدموية والتطبيقات المتعلقة بتكوين الأوعية الدموية في بعض الأورام الصلبة ، مثل تقليد الأوعية الدموية للورم في الورم الزجاجي.

يعد العرض الحقيقي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم توليد هذه الخطوة الكروية للخلايا البطانية التي تم التلاعب بها. لأن الحالة المناسبة مهمة. أولا ، استزراع الخلايا البطانية HUVEC في وسط زراعة DMEM المكملة بعشرة بالمائة من مصل الأبقار الجنينية والبنسلين والستربتومايسين.

بعد ذلك ، حافظ على الثقافة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، لتصنيع جزء shRNA ، قم بهضم البلازميد باستخدام إنزيمات تقييد ApaI و EcoRI. ثم إلى البلازميد المهضوم ، أضف كلا من oligos الأمامي والعكسي ، و 10x NEB المؤقت ، والماء المقطر المزدوج إلى الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولترا.

بعد إضافة جميع الكواشف ، سخني الخليط على حرارة 98 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. ثم تبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة في غضون ساعات قليلة. استخدم T4 ligase لربط oligos الملدنة والبلازميد.

احتضان الأنبوب عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج الربط إلى 25 ميكرولتر من الخلايا المختصة DH5alpha. في 500 ميكرولتر من وسط DMEM ، أضف ناقل الفيروس أو الناقل المخفوق ، جنبا إلى جنب مع بلازميدات التغليف الأخرى.

ثم احتضان خليط الفيروسات العدسية لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف 7 ملليلتر من وسط DMEM إلى المحلول المختلط المخفوق أو الفيروسي. استزراع الخلايا 293FT في وسط DMEM بدون مصل بقري جنيني في طبق استزراع 10 سم.

أضف ملليلترا واحدا من المحلول الفيروسي أو المخفوق إلى الخلايا التي يبلغ طولها 293FT في طبق الاستزراع. بعد ست ساعات ، استنشق الوسط القديم من طبق الثقافة. بعد ذلك ، استبدل الوسط القديم بوسط DMEM طازج يحتوي على 10 في المائة من مصل الأبقار الجنينية.

بعد 48 ساعة ، اجمع الوسط. انقل الخلايا البطانية HUVEC في وسط الفيروس العدسي واحتفظ بها لمدة 72 ساعة. بعد ذلك ، أضف ميكروغرامين لكل مليلتر من بورومايسين إلى وسط زراعة خلايا HUVEC.

أخيرا ، احتضن الثقافة لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم التالي ، أضف ملليلتر واحد من التربسين EDTA لتربسين خلايا HUVEC. ثم أعد تعليق معلق الخلايا التربسينية في وسط DMEM باستخدام مصل بقري الجنين بنسبة 10 بالمائة.

احسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. بعد العد ، قم بزرع الخلايا في صفيحة دائرية ثلاثية الأبعاد ذات 96 بئرا. بعد البذر ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة متواصلة.

بعد 36 ساعة ، استبدل نصف وسط الثقافة بوسط طازج. أولا ، قم بإذابة محلول الجل عند أربع درجات مئوية ، ثم قم بتخفيفه بنسبة واحد إلى خمس باستخدام وسط المصل المخفض. امتصاص الكرات من وسط DMEM باستخدام ماصة دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الكرات بخمسة ملليلتر من وسط المصل المخفض. انقل الكرويات العالقة والهلام المخفف بعناية. في طبق 15 بئر ، قم بتضمين 300 ميكرولتر من السائل المختلط من الكرويات والهلام المخفف.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من وسط المصل المخفض إلى بئر واحد. لمنع التبخر ، املأ محيط البئر بالماء المعقم.

بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، ورطوبة 100 في المائة لمدة ساعة. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسط القديم وأضف 600 ميكرولتر من وسط المصل المخفض مع مكمل نمو الخلايا البطانية بنسبة واحد بالمائة إلى البئر واحتضانه لمدة يوم. التقط الصور باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.

هنا ، يتم التقاط الإنبات الكروي للخلايا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب لدراسة تأثير إسكات جين VHL على إمكانات تولد الأوعية الدموية للخلايا البطانية. ينظر إلى الكروية على أنها تنبت بعد 12 ساعة من العلاج بالفيروسات العدسية في كل من الخلايا البطانية الضابطة والخلايا البطانية الصامتة VHL. بعد ذلك ، يتم إجراء التحليل الإحصائي لتحديد طول البراعم الناتجة عن جين VHL الكروي الصامت.

يبدو أن متوسط طول البرعم يبلغ حوالي 125 ميكرومتر في مجموعات VHL الصامتة بينما يبلغ حوالي 65 ميكرومترا فقط في المجموعة الضابطة. يبلغ متوسط طول البرعم التراكمي لمجموعة VHL الصامتة حوالي 1250 ميكرومتر بينما يبلغ طول البرعم التراكمي للمجموعة الضابطة 680 ميكرومتر. تشير هذه النتائج إلى زيادة طول البرعم بمقدار ضعفين في مجموعات VHL الصامتة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 48 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء والطريقة مثل اختبار تكوين الشعيرات الدموية يمكن إجراؤه من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. مثل استكشاف القدرة الوعائية للخلايا البطانية الوعائية.

بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تكوين الأوعية الدموية لاستكشاف الأوعية الدموية الداخلية للورم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للجينات التي تفقد وظيفة في الخلايا البطانية التي تم التلاعب بها والمستخدمة في الفحص المتفجر.