التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة ، مثل كيفية تغير بنية الحمض النووي أثناء دورة الخلية للبكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من الممكن تصور البنية التحتية للخلايا البكتيرية بأكملها بالقرب من الحالة الحية في نقاط زمنية مناسبة دون أي علاجات إضافية. سيوضح الإجراء تشيهونغ سونغ ، باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري ، وماكو هاياشي ، طالب دراسات عليا من مختبر الدكتور كانيكو.

ابدأ بزراعة البكتيريا الزرقاء على ألواح BG-11 معقمة بطول تسعة سنتيمترات تحتوي على 1.5٪ أجار و 0.3٪ ثيوسلفات الصوديوم. احتضان الألواح عند 23 درجة مئوية تحت دورة ضوئية 12-12 مع 50 ميكرو إي من الضوء لكل متر مربع في الثانية. للحفاظ على الخلايا ، انقلها إلى أطباق أجار BG-11 طازجة أسبوعيا.

في غضون أسبوع واحد ، تظهر الثقافات على شكل شرائط خضراء. انقل الكتل الخضراء من الخلايا باستخدام حلقة معقمة باللهب ، وقم بخطها على اللوحة الجديدة. لمراقبة ضغط الحمض النووي ، اجمع الخلايا المزروعة لمدة ستة أيام في نهاية فترة الضوء.

لتحرير الخلايا من اللوحة ، أضف ملليلتر واحد من السكروز 0.2 مولار. ثم اجمع معلق الخلية ، وكرر إضافة السكروز وإزالته حتى يتحول المحلول إلى اللون الأخضر. يشير تغيير اللون إلى أن معظم الخلايا قد تم إطلاقها.

الآن ، انقل 500 ميكرولتر من محلول الخلايا العالقة إلى أنبوب Microfuge ، وأضف صبغة Hoechst للحصول على تركيز نهائي يبلغ ميكروغرام واحد لكل مليلتر. ثم اترك الخلايا تحتضن في الظلام لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 10 ميكرولتر من السكروز 0.2 مولار.

بعد ذلك ، قم بنقل ميكرولتر واحد من التعليق إلى شريحة زجاجية ، ووضعه على زلة غطاء ، وراقب الخلايا تحت مجهر مضان مزود بمرشح للأشعة فوق البنفسجية. باستخدام هدف غمر الزيت 100 مرة ، ابحث عن دليل على ضغط الحمض النووي ، والذي يجب أن يكون ملحوظا في معظم الخلايا. أولا ، قم بإعداد جهاز تجميد الغاطس.

بعد ذلك ، قم بإعداد حاوية النيتروجين السائل عن طريق إدخال حاوية الإيثان ومرفق قضيب التبريد. بعد ذلك ، املأ الحاوية بالنيتروجين السائل ، وقم بتبريدها إلى درجة حرارة النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بتحميل غاز الإيثان في الحاوية.

تأكد من ارتداء نظارات السلامة ، لأن الإيثان السائل متفجر. أخيرا ، قم بإزالة ملحق قضيب التبريد ، وقم بتغطية الحاوية بغطاء بلاستيكي لتجنب الصقيع. للمضي قدما ، قم بتفريغ التوهج جانب الكربون لشبكة EM المطلية بالكربون لمدة 30 ثانية عند 50 مللي أمبير باستخدام حاجز أيون البلازما.

ثم قم بإعداد Vitrobot وفقا لبروتوكول الاختبار. استخدم الملقط لضبط شبكة EM المعالجة مسبقا على الغرفة. عالج شبكة EM بميكرولتر واحد ، 15 نانومتر BSA التتبع لتكون بمثابة علامة ائتمانية قبل تطبيق العينة.

الآن ، قم بنقل 2.5 ميكرولتر من تعليق الخلية على الشبكة. امسح أي محلول زائد باستخدام ورق الترشيح ، وقم بتجميد الشبكة على الفور في الإيثان السائل. احتفظ بالشبكة المجمدة مخزنة في النيتروجين السائل حتى يمكن فحصها.

بعد ذلك ، قم بتشغيل HVEM ، واضبطه على جهد عال يبلغ ميغا فولت واحد. بعد ذلك ، قم بتبريد حامل شبكة العينة إلى 150 درجة مئوية تحت الصفر باستخدام النيتروجين السائل. بمجرد أن تبرد ، قم بتركيب الشبكة المجمدة في حامل العينة المبردة ، وقم بتحميلها في HVEM.

احرص على تجنب تلويث الإعداد بالثلج. الآن ، حدد منطقة تصوير عند التكبير المنخفض 1 ، 000 مرة. بعد ذلك ، اضبط ارتفاع المحور z eucentric ، وقم بإمالة مرحلة العينة إلى سالب 60 درجة.

ثم قم بإزالة رد الفعل العكسي للدوران المائل. الآن ، ركز بالقرب من الموقع المستهدف بتكبير 10 ، 000 مرة. قم بتعيين تركيز بؤري تحت ستة إلى 10 ميكرون عن طريق الانحراف عن الصورة المركزة.

للتصوير ، اضبط الجرعة على إلكترونين لكل أنجستروم مربع في الثانية أو أقل. راقب جرعة الإلكترون ، التي تنعكس على الكثافة الحالية ، والتقط صورة بواسطة الكاميرا الرقمية أو على فيلم إلكتروني. بعد ذلك ، اجمع صور الإمالة من سالب 60 إلى موجب 60 درجة بزيادات من درجتين إلى أربع درجات.

استخدم الميزات الآلية للمجهر إن أمكن. افتح حزمة البرامج التجارية ، وقم بتحميل صور الإمالة لإعادة بناء المقطع. بعد ذلك ، قم بإنشاء ملف مكدس صور من الصور الفردية باستخدام الأمر tif2mrc أو newstack.

بعد ذلك ، ابدأ تشغيل برنامج eTomo GUI ، وأدخل معلمات الصورة لحجم البكسل والقطر الائتماني ودوران الصورة وما إلى ذلك. وبالتالي ، قم بإنشاء برنامج نصي التحرير. الآن ، استخدم البرنامج المقترح لإنشاء سلسلة إمالة ، محاذاة باستخدام علامات ائتمانية ، بمتوسط خطأ متبقي أقل من 0.5.

أخيرا ، أعد بناء مخطط مقطعي ثلاثي الأبعاد باستخدام خوارزمية SIRT. الآن ، استخرج منطقة ذات أهمية من التصوير المقطعي ، وقم بتطبيق مرشح تقليل الضوضاء ، مثل مرشح الانتشار متباين الخواص ، أو مرشح ثنائي ، أو مرشح مورفولوجيا رياضي. قم بإجراء التصفية باستخدام المعلمات التي تعزز تباين الصورة.

بعد ذلك ، قم بتقسيم ميزة ذات أهمية. استخدم ميزة التقطيع لفتح التصوير المقطعي. ثم انتقل إلى نافذة محرر التجزئة، وحدد حقل تسمية جديد لإنشاء ملف تجزئة.

بعد ذلك ، تتبع حدود الميزة ذات الأهمية يدويا في الشريحة الأولى ثم كل شريحة أخرى. يمكن إضافة ميزة إضافية ذات أهمية باستخدام نفس العمليات. الآن، لإنشاء عرض سطح باستخدام الخيارات الموجودة في قائمة SurfaceGen لتصور وحدة التخزين المجزأة، حدد قائمة SurfaceView.

لنقل وحدة الصوت ثلاثية الأبعاد وتدويرها وتكبيرها، استخدم الأدوات الموجودة في نافذة 3D Viewer. يمكن إجراء التجزئة التلقائية باستخدام أداة Magic Wand. انقر فوق كائن، واضبط أشرطة التمرير في العرض والإخفاء بحيث يتم تحديد ميزات الكائن بالكامل.

في ثقافة متزامنة دقيقة ، يظهر الحمض النووي المسمى ب Hoechst توزيعا موحدا طبيعيا في حالة الظلام ثم ينضغط تدريجيا داخل الخلية خلال فترة الضوء ، ويأخذ بنية متموجة تشبه القضيب بنهاية فترة الضوء. أخيرا ، ينقسم القضيب في المركز ، ويتم توزيع جزأيه في الخلايا الوليدة. بعد انقسام الخلية ، يختفي الحمض النووي المضغوط على الفور ، ويعود الحمض النووي إلى التوزيع المنتظم الطبيعي.

عندما تم تجميد الخلايا في المرحلة النهائية من ضغط الحمض النووي ومراقبتها باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني عالي الجهد ، أظهر العديد منها ضغطا مميزا للحمض النووي يمكن تمييزه بسهولة عن الخلايا الطبيعية. أظهر البعض انقباضا في وسط الخلايا ، كما هو متوقع قبل انقسام الخلية. من التصوير المقطعي ثلاثي الأبعاد ، يتم فصل الحمض النووي المضغوط بشكل واضح في السيتوبلازم وتحيط به مادة منخفضة الكثافة.

يتم تشويه طبقات غشاء الثايلاكويد على طول القضيب المتموج للحمض النووي المضغوط. ومن المثير للاهتمام أن العديد من أجسام الفوسفات الصغيرة تلتصق بالحمض النووي المضغوط وعادة ما تظهر في أزواج. قد تكون أجسام البولي فوسفات هذه هي موردي الفوسفات لتخليق الحمض النووي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور البنية التحتية للخلايا البكتيرية بأكملها بالقرب من الحالة الحية في النقطة الزمنية المناسبة عن طريق المجهر الإلكتروني عالي الجهد بالتبريد دون أي علاج إضافي مثل التلوين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن حالة ضغط الحمض النووي تتغير مع كل دقيقة في نهاية دورة الضوء. تأكد من عدم تفويت أفضل توقيت لتجميد العينة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل CLEM من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول توطين بروتينات أو نيوكليوتيدات معينة في الحمض النووي المضغوط. بعد تطويرها ، يجب أن تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف انقسام الخلايا ، وفصل الحمض النووي ، والعدوى الفيروسية في البكتيريا أو في حقيقيات النوى الصغيرة.