إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار تقنية لإدخال الجسيمات الدقيقة في الدورة الدموية لسمك الزرد البالغ عن طريق الحقن في كلية السمكة. يتم تصور الجسيمات الدقيقة التي تم إدخالها بشكل أكبر في الأوعية الدموية من خلال تقنية بسيطة للتصوير داخل الحيوية في خياشيم الأسماك. يمكن استخدام هذا الإجراء ، على سبيل المثال ، لإجراء قياسات متكررة لدرجة الحموضة في دم الأسماك في الجسم الحي عن طريق إدخال مجسات الفلورسنت المغلفة بطبقة صغيرة من أجل درجة الحموضة.

للقيام بذلك ، في المرحلة الأولى ، يتم تغليف الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني SNARF-1 المترافقة مع ديكستران في غلاف البولي إلكتروليت شبه المنفذ باستخدام نهج طبقة تلو الأخرى. يتم ترسيب صبغة الفلورسنت بشكل مشترك في نوى دقيقة مسامية من كربونات الكالسيوم ، ويتم طلاء النوى بطبقات متعددة من البوليمرات غير القابلة للتحلل المشحونة بشكل معاكس ومغلفة عليا ببوليمر متوافق حيويا يحتوي على البولي إيثيلين جلايكول. بعد ذلك ، يتم حل نوى كربونات الكالسيوم للحصول على كبسولات دقيقة كاملة تحيط ب SNARF-1.

في المرحلة الثانية من تخدير الأسماك وتثبيتها ، يتم حقن الكبسولات الدقيقة المحضرة مباشرة في كلية لتوصيل صبغة مغلفة إلى الدورة الدموية للأسماك. بعد ذلك ، هناك حاجة إلى الحد الأدنى من الجراحة لإزالة غطاء الخياشيم وتعديد الشعيرات الدموية من خياشيم الأسماك. بعد ذلك ، يمكن تصور الكبسولات الدقيقة في الدم وتسجيل طيف الفلورسنت في الجسم الحي عن طريق الفحص المجهري داخل الحيوية لمراقبة درجة الحموضة في الدم.

عندما يتم إجراء الحقن بشكل صحيح ، من الممكن ملاحظة الكبسولات الدقيقة الفلورية في خياشيم الأسماك مباشرة بعد العملية. يمكن تسجيل طيف الإزهار للمسبار المغلف باستخدام مقياس طيف مقترن بمجهر فلوري. يحتوي SNARF-1 على ذروتين للانبعاث ، ويمكن استخدام النسبة بين طولين موجيين يقابلان هذين القمتين لقياس الأس الهيدروجيني.

يسمح الإجراء المقترح بتوصيل الكبسولات الدقيقة الفلورية إلى نظام الدورة الدموية للأسماك ومراقبة التألق عن بعد في دم الأسماك في الجسم الحي. في حالة البحث الفسيولوجي ، فإن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي القياسات المتكررة لمعلمات الدم في المختبر الصغيرة ، والتي يصعب إجراؤها عادة. إذا تم استخدام مسبار فلورسنت حساس للضوء ، فمن المستحسن تنفيذ الإجراء بأكمله في غرفة مخفضة الضوء.

امزج ملليلترين من محلول صبغة الفلورسنت المختارة المرتبطة بالبوليمر هنا ، SNARF-1-dextrain ، مع 0.6 ملليلتر من محلول كلوريد الكالسيوم المولي و 0.6 ملليلتر من محلول كربونات الصوديوم المولي تحت التحريك السريع. في هذه الخطوة ، يتم تصنيع النوى الدقيقة المسامية لكربونات الكالسيوم التي تحيط بصبغة الفلورسنت. بعد خمس ، 10 ثوان من التحريض ، انقل التعليق إلى مليلترين من الأنابيب الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية إلى حبيبات كربونات الكالسيوم microcores.

تخلص من المادة الطافية ، واغسل النوى بحوالي ملليلترين من الماء منزوع الأيونات ، وقم بهز التعليق. كرر إجراء الطرد المركزي والغسيل ثلاث مرات. احتضان التعليق لمدة دقيقة واحدة في حمام بالموجات فوق الصوتية لتقليل تراكم النوى الدقيقة.

أعد تعليق النوى الدقيقة لكربونات الكالسيوم في ما يقرب من ملليلترين من محلول أربعة ميكروغرام لكل مليلتر من البوليمر الكاتيوني PAH لإيداع الطبقة البوليمرية الأولى على القوالب. احتفظ بالنوى الدقيقة في محلول الأس الهيدروجيني لمدة خمس دقائق مع الاهتزاز المستمر. بعد 15 ثانية من الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية مع الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات غير المقيدة واغسل النوى الدقيقة بالماء ثلاث مرات عن طريق خطوات متعددة للطرد المركزي والغسيل.

كرر نفس الإجراء بمحلول أربعة ملليغرام لكل مليلتر من البوليمر الأنيوني PSS لإيداع الطبقة البوليمرية الثانية على القوالب. قبل إضافة الطبقة التالية مباشرة ، ينصح بتطبيق حضانة دقيقة واحدة في حمام بالموجات فوق الصوتية. كرر بالتتابع ترسب البوليمرات الموجبة والأنيونية ست مرات للحصول على غلاف كبسولة دقيقة مكون من 12 طبقة.

بعد ذلك ، احتضان النوى الدقيقة مع الأصداف في بولي إل ليسين المطعمة بالبولي إيثيلين جلايكول لمدة ساعتين على الأقل. بعد ذلك ، اغسل النوى الدقيقة المغطاة مرة واحدة بالماء عن طريق الطرد المركزي المتسلسل وإعادة التعليق. أخيرا ، قم بإذابة قوالب كربونات الكالسيوم في ملليلترين من محلول EDTA 0.1 مولار ، مع تعديله على درجة الحموضة حوالي 7.1 ، للحصول على كبسولات دقيقة مجوفة.

تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي لمدة 45 ثانية، وكرر الغسيل باستخدام EDTA مرتين. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي لمدة 45 ثانية ، وأضف ملليلترين من المحلول الملحي. كرر غسل خطوات الطرد المركزي بالمحلول الملحي ثلاث مرات.

التحقيق في توزيع حجم وتركيز الكبسولات الدقيقة المحضرة في مقياس كثافة الدم تحت المجهر الفلوري. استخدم ImageJ أو برنامج مكافئ لتحليل حجم الجسيمات. قم بتخزين المسبار المغلف الذي تم الحصول عليه في الظلام.

لإعداد النظام البصري ، ضع المجموعة المطلوبة من مرشحات الفلورسنت على المجهر الفلوري وفقا لخصائص صبغة الفلورسنت المطبقة ، وقم بتشغيل مصباح الفلورسنت. اسحب الرافعة إلى العدسات. قم بتوصيل الألياف الضوئية من أحد طرفيها إلى مقياس الطيف وعلى الطرف الآخر بالموازاة.

باستخدام المحولات ، قم بتشغيل الموازاة في بؤرة أنبوب الكاميرا أو أي منفذ آخر متاح لمجهر الفلورسنت. لمعايرة الكبسولات الدقيقة المحضرة ، ضع حوالي خمسة ميكرولترات من تعليق الكبسولة الدقيقة على شريحة مجهرية ، وجفف القطرة في مكان مظلم. قم بتشغيل مقياس الطيف.

قم بتشغيل برنامج التحكم في مقياس الطيف ، وقم بإعداد مقياس الطيف للقياسات. لمعايرة الخصائص الطيفية ل SNARF-1 المغلفة بالميكروكسول ، استخدم سلسلة من المخازن المؤقتة ذات درجة الحموضة المختلفة. قم بإسقاط حوالي 10 ميكرولترات من محلول الصوديوم على الكبسولات الدقيقة المجففة باستخدام SNARF-1 ، وقم بتغطيتها بغطاء غطاء.

ضع شريحة زجاجية على مرحلة المجهر. حدد موقع الكبسولات الدقيقة باستخدام تكبير حوالي 400. أدر ذراع المجهر إلى منفذ الكاميرا.

سجل التألق باستخدام مقياس الطيف. تأكد من أن الإشارة الطيفية تتجاوز مستوى الخلفية ، ولاحظ أن الكبسولات الدقيقة ليست في فقاعة. تجنب الإضاءة لفترات طويلة لنفس الكبسولات الدقيقة مثل SNARF-1 حساسة للتبييض الضوئي.

أدر الرافعة مرة أخرى إلى العدسات. احسب نسبة شدة التألق ل SNARF-1 المغلف عند الطول الموجي المقابل لقمم انبعاث الصبغة البروتونية ومنزوعة البروتون. قم ببناء منحنى معايرة لنسبة الاعتماد على درجة الحموضة للوسط.

اجمع حوالي 10 ميكرولترات من الدم من الأسماك التي تم القتل رحيم. حدد الأس الهيدروجيني بواسطة مقياس الأس الهيدروجيني باستخدام قطب كهربائي صغير. بعد ذلك ، قم بإسقاط الدم على الشريحة باستخدام كبسولات دقيقة مجففة ، وسجل نسبة شدة التألق كما هو موضح لمخازن المعايرة.

نظرا لأنه يجب أن تأخذ في الاعتبار تأثير مكونات الدم على قراءة SNARF-1 المغلف ، اضبط المعامل الخطي لمنحنى المعايرة لجعل المنحنى يتطابق مع القياسات في دم السمكة. لتحضير إبرة للحقن ، حرر إبرة فولاذية من طرف حقنة الأنسولين عن طريق إزالة البلاستيك بإبرة حادة. أدخل الإبرة في منتصف الطريق في الشعيرات الدموية الزجاجية.

بلحامه بسرعة وبلطف بواسطة شعلة غاز. قم بتوصيل الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية بالحاقن الدقيق ، واغسلها بالماء المعقم لمدة ثلاث مرات. تأكد من تدفق السائل عبر الإبرة.

املأ النظام بالماء. تأكد من عدم وجود فقاعات في النظام. في يوم التجربة ، خذ المعلق المحضر من الكبسولات الدقيقة في محلول ملحي معقم يحتوي على نصف إلى ستة ملايين من الكبسولات الدقيقة لكل ميكرولتر.

أعد تعليقه بواسطة الحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقة واحدة. أثناء الحقن التالي ، رج القارورة بشكل دوري لإعادة تعليق الكبسولات الدقيقة ومنع تجميعها. باستخدام ملعقة ، أخرج السمكة من التخدير ، وضعها برفق على إسفنجة رطبة في وضع جانبي مع وضع الرأس باتجاه اليسار إذا كنت تستخدم اليد اليمنى أو باتجاه اليمين إذا كنت أعسر.

قبل الحقن مباشرة ، امتصاص ملليمتر إلى ملليمترين من الهواء في الشعيرات الدموية الزجاجية المتصلة بالحاقن الدقيق. ثم قم بتحميله بما يقرب من ميكرولتر من الكبسولات الدقيقة المشتتة. قم بتثبيت جسم السمكة برفق على الإسفنجة بيدك غير المهيمنة.

ابحث عن الخط الجانبي للسمكة. ضع الإبرة ملليلتر واحد أسفل نقطة منتصف الجزء البطني من الخط الجانبي. ثم ، من خلال حركة كشط ، حرك مقياس السمك جانبا ، وقم بعمل ثقب.

أدخل الإبرة في الجسم بزاوية 45 درجة على سطح الطاولة. ادفع الإبرة نحو العمود الفقري حتى تستقر بعناية على العمود الفقري. بعد ذلك ، حرر ببطء حوالي ميكرولتر واحد من تعليق الكبسولة الدقيقة في الكلى ، واسحب الإبرة ببطء.

اشطف السمكة من الرأس إلى الذيل بتيار من الماء لإزالة الكبسولات الدقيقة المنسكبة في موقع الحقن. استخدم مقص التشريح لإزالة غطاء الخياشيم من رأس السمكة وتعميد خياشيم السمك. شطف الخياشيم بالماء.

باستخدام ملعقة ، انقل السمكة إلى شريحة مجهرية ، وضعها على مسرح المجهر الفلوري. عند تنفيذ الإجراءات التالية ، تأكد من أن خياشيم الأسماك لا تجف. للقيام بذلك ، قم بترطيبها بشكل دوري بالماء باستخدام ماصة باستور.

بتغميق الغرفة وباستخدام التكبير المنخفض ، افحص الخياشيم للعثور على كبسولات دقيقة فلورية. عندما تعثر عليها ، قم بتبديل العدسة إلى حجم أعلى ، وضعها في وسط مجال الرؤية. أدر الرافعة إلى المنفذ باستخدام مطياف متصل.

سجل الإشارة الطيفية. أدر الرافعة مرة أخرى إلى العدسات. كرر القياسات لكبسولات دقيقة مختلفة عدة مرات.

انقل الأسماك إلى الحوض مع التهوية المناسبة للتعافي. يمكن تكرار إجراء القياس لفرد واحد لعدة مرات باستخدام التخدير المتكرر أو طريقة أخرى للتثبيت. تظهر الصورة مثالا تمثيليا للقياسات في الجسم الحي لدم الزرد وفرط الغطاء بواسطة صبغة الفلورسنت المغلفة SNARF-1.

في ظروف التحكم ، يظل الرقم الهيدروجيني في الدم مستقرا خلال أربع ساعات بعد حقن الكبسولات الدقيقة ، بينما يؤدي التعرض لمدة خمس دقائق تحت ارتفاع ثاني أكسيد الكربون إلى تحمض دم السمك. أثناء تنفيذ الإجراء ، من المهم تقليل الإجهاد الحيواني الناجم عن المناولة والجراحة. مع بعض الممارسة ، يستغرق كل من الحقن وتسجيل الإشارة في المتوسط حوالي دقيقتين أو ثلاث دقائق ، لذلك يسمح هذا البروتوكول بإكمال التلاعب قبل أن تستيقظ الأسماك من التخدير الخفيف.

أثناء الإجراء ، تأكد من ترطيب خياشيم الأسماك دائما. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية زرع بسيطة وفعالة للجسيمات الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة. كما هو موضح ، هذه التقنية مريحة جدا للتسجيلات المتكررة في الجسم الحي لدرجة الحموضة في الدم في أسماك الزرد البالغة باستخدام كبسولات دقيقة مملوءة بمسبار الفلورسنت.