أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار
أغسطس 25, 2018
نقدم هنا بروتوكولا لكفاءة عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. يبسط هذا الأسلوب الإجراء التقليدي باستخدام Y-27632 مثبط لموسيقى الروك في الأجلين المتوسط والتطعيم بصورة عفوية فصل خلايا البشرة من خلايا الجلد.
الهدف العام من هذا الفيديو هو تقديم طريقة بسيطة جديدة لعزل واستزراع خلايا البشرة البشرية الأولية من أنسجة الجلد البالغة. هذه الطريقة المتقدمة أكثر ملاءمة لإنتاج عدد كبير من خلايا البشرة عالية الإمكانات لكل من التطبيقات المختبرية والسريرية. اغسل المنديل باستخدام PBS قبل الوزن.
قم بوزن أنسجة الجلد بميزان إلكتروني. اشطف أنسجة الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. احتضان الأنسجة في PBS بالمضادات الحيوية مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة.
انقل الأنسجة إلى طبق معقم آخر وقم بتجانسها جيدا باستخدام شفرات مشرط. أضف 200 ميكرولتر من PBS كل خمس دقائق للحفاظ على الأنسجة رطبة. نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب 50 ملليلتر.
أضف 10 مل من خليط الإنزيم لكل جرام واحد من أنسجة الجلد. امزج الإنزيمات جيدا مع الأنسجة المتجانسة. احتضن الخليط في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الرج.
بعد ذلك ، أضف 1/5 حجم 0.25٪ تريبسين. استمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية. أضف محلول Dnase I إلى الخليط بنسبة واحد إلى 100.
ثم احتضن لمدة خمس دقائق أخرى. أوقف عملية الهضم بإضافة نفس الحجم من وسط التحييد. ماصة المحلول لأعلى ولأسفل لمدة 20 مرة تقريبا.
قم بتصفية الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر لإزالة بقايا الأنسجة. جهاز طرد مركزي بوزن 200 جم لمدة خمس دقائق. راقب الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب.
قم بإزالة المواد الطافية واغسل حبيبات الخلية ب 10 مل من وسط التحييد. ثم جهاز الطرد المركزي عند 200 غرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط التلقيح باستخدام 10 مثبطات ميكرومولار ROCK.
لوحة مرتين 10 إلى الخلايا السادسة في طبق ثقافة 100 ملم. بعد ثلاثة أيام ، استبدل وسط التلقيح بوسط الخلايا الكيراتينية الخالي من المصل. قم بتغيير الوسيط كل يومين.
عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من الكثافة ، قم بتمرير الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام PBS. إذا لزم الأمر ، قم بالتربسين لمدة دقيقتين وغسل الخلايا باستخدام PBS لإزالة الخلايا الجلدية الملوثة.
أضف نفس الحجم من وسيط التحييد. جهاز طرد مركزي بوزن 200 جم لمدة خمس دقائق. أخيرا ، قم بإزالة المواد الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية.
تم تحضين الخلايا الكيراتينية المعزولة من أنسجة جلد الإنسان بشكل منفصل بطريقتين. الطريقة التقليدية هي عملية هضم من خطوتين تتضمن إجراء لمدة يومين. على النقيض من ذلك ، فإن الطريقة الجديدة عبارة عن عملية هضم من خطوة واحدة تستغرق حوالي ثلاث ساعات لأدائها.
في اليوم الثالث ، يمكننا بسهولة العثور على العديد من مجموعات الخلايا المزروعة بالطريقة الجديدة بينما لا تحدث هذه الظاهرة عند استخدام الطريقة التقليدية. في اليوم الخامس ، لوحظ أن الطريقة الجديدة أنتجت كمية أكبر من الخلايا الأولية. لاختبار حالة التمايز للخلايا الكيراتينية المستنبتة ، قمنا بتحليل علامة الخلايا القاعدية K5 وعلامة التمايز الطرفية Loricrin.
وجدنا أن 90٪ من إجمالي الخلايا كانت إيجابية K5 ، لكن أقل من 10٪ من الخلايا عبرت عن Loricrin عند المرور الثالث ، مما يشير إلى أنها خلايا كيراتينية غير متمايزة. قمنا بفحص تعبير الفيمنتين الذي يتم التعبير عنه في الخلايا الليفية الجلدية لفحص تلوث الخلايا الجلدية أثناء العزلة. وجدنا أن حوالي 3٪ من الخلايا الجلدية ظهرت في الممر الأولي ، ولكن تم اكتشاف حوالي 0.02٪ فقط من الخلايا الجلدية عند المرور الثالث ، مما يشير إلى نقاء عال لخلايا البشرة بعد المرور.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مبسطاً لعزل الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية من أنسجة الجلد لدى البالغين. تعتمد هذه الطريقة على استخدام مثبط ROCK Y-27632 لتسهيل فصل الخلايا البشرية عن الخلايا الأدمية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- طب الأمراض الجلدية
- الطب التجديدي
خلفية علمية
- تعتبر الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية ضرورية لمختلف التطبيقات البحثية.
- يمكن أن تكون طرق العزل التقليدية معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً.
- يوفر استخدام مثبط ROCK Y-27632 نهجاً أكثر كفاءة.
- يمكن استخدام الخلايا الكيراتينية المعزولة في كل من البيئات المختبرية والسريرية.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة أكثر كفاءة لعزل الخلايا البشرية.
- تعزيز إنتاجية الخلايا البشرية ذات الإمكانات العالية.
- تسهيل الأبحاث والتطبيقات السريرية التي تتضمن خلايا الجلد.
الطرق المستخدمة
- اغسل أنسجة الجلد باستخدام PBS قبل عملية الوزن.
- زن أنسجة الجلد باستخدام ميزان إلكتروني.
- اشطف الأنسجة باستخدام ethanol بتركيز 70% لمدة 30 ثانية.
- قم بتحضين الأنسجة في PBS مع مضادات حيوية مرتين لمدة خمس دقائق في كل مرة.
النتائج الرئيسية
- ينجح هذا البروتوكول في عزل الخلايا الكيراتينية الأولية.
- تم الحصول على عوائد عالية من الخلايا البشرية القابلة للحياة.
- تتميز هذه الطريقة بأنها قابلة للتكرار وفعالة.
- يمكن استخدام الخلايا المعزولة في تطبيقات متنوعة.
الاستنتاجات
- تبسط هذه الطريقة عملية عزل الخلايا الكيراتينية الأولية.
- توفر هذه الطريقة منهجية موثوقة للباحثين في هذا المجال.
- يؤدي استخدام ROCK Inhibitor إلى تعزيز إنتاجية الخلايا وحيويتها.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال عزل الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية عالية النقاء من جلد البالغين يمثل عقبة في مجالي البحث والتطوير في الأمراض الجلدية والطب التجديدي، وذلك بسبب انخفاض العائد ومخاطر التلوث. تعمل هذه الطريقة الإنزيمية المبسطة المكونة من خطوة واحدة، والمقترنة بمثبط ROCK Y-27632، على تحسين استعادة الخلايا البشرية والقدرة الجذعية، مما يتيح إنتاجاً قابلاً للتوسع للتحقق من الأهداف والنمذجة قبل السريرية. ويقلل هذا النهج من تعقيد الإجراءات والوقت المستغرق، مما يدعم تطوير مقايسات قابلة للتكرار والاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى تحسين المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء مسارات إشارات البشرة ومدى الارتباط بالهدف في نظام خلايا بشرية ذي صلة فسيولوجياً.
- القيمة التشغيلية: توفر مصدراً متجدداً من الخلايا الكيراتينية الأولية بنقاء عالٍ من K5+/Loricrin- لضمان تقليل مخاطر الهدف بشكل متسق.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال الحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية وانخفاض تلوث الخلايا الليفية (أقل من 0.02% عند P3) لضمان موثوقية فحص النمط الظاهري.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يولد أعداداً كبيرة من الخلايا البشرية القابلة للحياة والمناسبة لفحص المركبات عالي الإنتاجية واختبار السُمية الخلوية.
- التوحيد القياسي: يعمل بروتوكول الهضم المكون من خطوة واحدة (حوالي 3 ساعات) على تحسين إمكانية تكرار النتائج عبر الدفعات والمختبرات المختلفة.
- القابلية للتوسع: يلغي عملية فصل البشرة عن الأدمة، مما يسمح بالتطبيق على أنسجة بالغة متنوعة وزيادة الإنتاجية في حملات تحديد المركبات الرائدة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: يُنتج خلايا كيراتينية ذات خصائص الخلايا الجذعية التي تحاكي التوازن البشرى للبشرة ووظيفة الحاجز الجلدي.
- الاستمرارية الانتقالية: يحافظ على الاستقرار المظهري عبر عمليات الممرات الخلوية، مما يدعم اختبارات الفعالية والسلامة قبل السريرية.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تساهم النقاوة والعائد المرتفعان في تقليل التباين البيولوجي، مما يعزز الثقة في قرارات المضي قدماً أو التوقف بالنسبة للمرشحات الموضعية أو التجديدية.
تكامل سير العمل ومسارات المعالجة
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف من خلال توفير خلايا كيراتينية بشرية أولية مصادق عليها للتحقق المبكر من الأهداف، مما يتيح تطوير المقايسات لحملات الفحص، ودعم التقييم قبل السريري للعلاجات الجلدية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات على الأهداف البشروية باستخدام نظام خلايا بشرية منقاة ومثرية بالخلايا الجذعية.
- الفحص: توفر تحضيرات خلوية كمية ومعيارية لقياسات الاستجابة للجرعة والمؤشرات الحيوية في تقييم المركبات.
- التحليلات: تمكن من قياس مؤشرات التمايز (K5, Loricrin) ومستويات التلوث (vimentin) لتقييم النمط الظاهري الخلوي والنقاء.
- البحث الانتقالي: تدعم الاستمرارية من الخلايا الأولية المعزولة إلى النماذج قبل السريرية من خلال الحفاظ على الخصائص الجذعية والوظيفية للبشرة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة عزل قابلة لإعادة الاستخدام وتطبق عبر مشاريع متعددة تتطلب خلايا بشروية بشرية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الهدف من خلال إنتاج خلايا كيراتينية عالية النقاوة ومثرية بالخلايا الجذعية.
- القيمة التشغيلية: تقلل وقت العزل من يومين إلى حوالي 3 ساعات، مما يحسن الإنتاجية المختبرية وكفاءة الموارد.
- القيمة الاستراتيجية: تعزز الثقة التنبؤية في البرامج في مراحلها المبكرة من خلال تقليل الضوضاء البيولوجية الناتجة عن التلوث الأدمي.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات المرشحين بناءً على تقييم المخاطر استناداً إلى مقايسات موثوقة تعتمد على الخلايا البشرية الجلدية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الأولية وتقنيات تفكيك الأنسجة الإنزيمية.
- يستلزم الوصول إلى مثبط ROCK Y-27632، وخليط الإنزيمات (مثل dispase وtrypsin)، وDNase I لعملية الهضم.
- يتطلب استخدام طرق معيارية في الطرد المركزي والترشيح والتقنيات المعقمة للحفاظ على حيوية الخلايا ونقائها.
- يتطلب تكييف تركيبات أوساط التلقيح والخلايا الكيراتينية لتحقيق التوسع والمنقولات المثلى.
- تشمل القيود العملية التباين بين المانحين في جودة أنسجة الجلد والحاجة إلى التعامل العقيم لمنع التلوث الميكروبي.
