تصور التفاعل بين المسمى قدوت البروتين والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي تم التعديل على مستوى جزيء واحد

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تصوير الجزيء الفردي لتفاعلات بروتين الحمض النووي مثل تكرار الحمض النووي وإصلاح الجينات والحفاظ على بنية الكروموسوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء الحصول على الكولاجين العالي من الحمض النووي المعدل من لامدا ثم علاج البروتينات المسماة بسرعة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه يصعب تعلم خطوات تجميع خلايا التدفق.

لتنظيف أغطية الغطاء ، ضع 20 غطاء في أربعة برطمانات تلطيخ ، واسكب الإيثانول فيها وصوتنة لمدة 30 دقيقة في الإيثانول. ثم اشطف الأغطية بالماء عالي النقاء ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بصوتنة الأغطية باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم المولي لمدة 30 دقيقة واشطف الأغطية بالماء عالي النقاء ثلاث مرات.

ثم كرر صوتنة الإيثانول وهيدروكسيد البوتاسيوم مرة واحدة. قم بتسخين الغطاء بالأسيتون لمدة 30 دقيقة ثم اشطفه جيدا بالماء فائق النقاء. الآن ضع الغطاء في محلول سمكة البيرانا واحتضنه عند 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، اشطف الغطاء بالماء فائق النقاء خمس مرات. ثم اغسل كل غطاء على نطاق واسع بالماء فائق النقاء. استخدم الورق لتجفيف الغطاء من حافته ووضع الغطاء في وعاء تلطيخ.

جفف الغطاء جيدا في فرن 110 درجة مئوية. الآن اشطف الغطاء بالميثانول ثم ضع جرة التلوين مرة أخرى في فرن 110 درجة مئوية لتجفيف الغطاء. لأداء وظيفة الغطاء ، أضف 70 مل من محلول Silane في كل برطمان ، وقم بلف الغطاء واترك البرطمان في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

اغسل الغطاء باستخدام ثلاث أكواب مملوءة بالماء فائق النقاء. جفف الغطاء جيدا باستخدام غاز النيتروجين. قم بإذابة 150 ملليغرام من ميثوكسي-PEG وستة ملليغرامات من البيوتين-PEG في مليلتر واحد من بيكربونات الصوديوم 0.1 مولار المحضرة حديثا.

جهاز طرد مركزي عند 17 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة لإزالة PEGs غير القابلة للذوبان. الآن ماصة 100 ميكرولتر من محلول PEG في وسط الغطاء السيلاني وضع غطاء سيلاني آخر في الأعلى. احتضن الأغطية بمحلول PEG لمدة ثلاث ساعات على الأقل في الظلام.

افصل أزواج الغطاء وحافظ على السطح الوظيفي متجها لأعلى. اشطف الأغطية على نطاق واسع باستخدام ماء فائق النقاء وجففها بغاز النيتروجين. الآن ضع علامة على الجانب الوظيفي من أغطية الغطاء على أحد الزوايا باستخدام قلم تحديد.

ضع غطاء واحد في أنبوب سعة 50 مليلتر محفور بفتحة واحدة على غطاءه. ضع الأنبوب في كيس بلاستيكي ، وأغلق الكيس باستخدام جهاز تفريغ الهواء وقم بتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتجميع خلية التدفق ، قم بقص قناة في وسط قطعة من الشريط على الوجهين باستخدام مثقب.

انزع الجانب الورقي من الشريط على الوجهين والصقه على جانب زجاجي به فتحتان. من الأسهل إزالة فقاعات الهواء عن طريق تقشير جانب الورق بدلا من الجانب البلاستيكي للشريط على الوجهين. اضغط على الشريط لإزالة فقاعات الهواء.

ثم قم بقص غطاء وظيفي إلى أربع قطع باستخدام كاتب زجاجي ذو رأس ماسي وقم بإزالة الحطام باستخدام غاز النيتروجين مع الحفاظ على الجانب الوظيفي لأعلى. انزع الجانب البلاستيكي من الشريط على الوجهين والصق الشريحة على الغطاء الوظيفي. اضغط برفق لإزالة فقاعات الهواء بين الغطاء والشريط اللاصق.

يمكن أن تؤدي إزالة فقاعات الهواء تماما إلى حماية خلية التدفق من التسرب أثناء ضخ المخازن المؤقتة فيها. الآن أدخل أنبوب المدخل في الفتحة الصغيرة وأدخل أنبوب المخرج في الفتحة الكبيرة. إصلاح الأنبوب باستخدام الايبوكسي.

قم بضخ 20 ميكرولتر يدويا من 0.2 ملليغرام لكل مليلتر من الستربتافيدين في خلية التدفق باستخدام حقنة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم ضخ المخزن المؤقت المانع في خلية التدفق لتحل محل Streptavidin والاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة. احصل على المحاذاة البؤرية للأحمر الأحمر والأحمر البعيد مع A5 على شريحة اختبار المجهر الفلوري رقم واحد عن طريق الإثارة المتزامنة باستخدام ليزر 532 نانومتر وليزر 640 نانومتر.

إنتاج صور مزدوجة الطول الموجي مع بصريات مقسمة. ضع خلية التدفق على المجهر وقم بتوصيل أنبوب مخرج بأنبوب أطول متصل بنابض سعة 10 مل مثبت على مضخة آلية قابلة للبرمجة لسحب التسريب. قم بإزالة فقاعات الهواء في خلية التدفق عن طريق حقن المخزن المؤقت المحظور وتقليب أنبوب المخرج.

أضف 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي لامدا-ARS317 البيوتينيل إلى 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت المانع. قم بضخ الخليط المحضر في خلية التدفق بسرعة 25 ميكرولتر في الدقيقة لمدة دقيقتين. ثم اغسل الحمض النووي lambda-ARS317 باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة.

الآن قم بضخ 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة لإزالة المخزن المؤقت للحجب في خلية التدفق. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من ORC-Qdot705 ، وميكرولتر واحد من DTT ، وميكرولتر واحد من ATP إلى 96 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم. التركيز النهائي ل ORC-Qdot705 هو 0.2 نانو مولار.

بعد ضخ المخزن المؤقت الملزم كما هو مفصل في بروتوكول النص ، قم بضخ 20 ميكرولترا من محلول ORC-Qdot705 المحضر بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة في خلية التدفق. اتخلص من ORC-Qdot705 المفرط باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم بمعدل 100 ميكرولتر في الدقيقة. ثم قم بضخ مخزن مؤقت ملزم ب 30 نانومولار SYTOX Orange في خلية التدفق لتلطيخ ركائز الحمض النووي بمعدل 100 ميكرولتر في الدقيقة.

أخيرا ، قم بإثارة إشارة ORC-Qdot705 باستخدام ليزر 405 نانومتر وإثارة إشارة الحمض النووي الملون SYTOX Orange باستخدام ليزر 532 نانومتر. راقب الإشارات في وقت واحد بتدفق 100 ميكرولتر في الدقيقة باستخدام مرشح ممر النطاق رباعي النطاق. سجل الصور بواسطة EMCCD بمعدل 100 مللي ثانية لكل إطار.

الرسم التوضيحي لركيزة الحمض النووي lambda-ARS317 هنا. كان ORC المسمى Qdot705 متحمسا لليزر 405 نانومتر. كان الحمض النووي الملون باللون البرتقالي SYTOX متحمسا بواسطة ليزر 532 نانومتر.

تشير النتيجة المدمجة إلى أن ORC المسمى Qdot705 يرتبط ب ARS317. تظهر نتيجة توزيع ربط ORC على الحمض النووي lambda-ARS317 أن ORC يرتبط في ARS317 بوفرة عالية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل FRET أحادي الجزيء من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بتفاعلات البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصوير الفلوري أحادي الجزيء لاستكشاف تفاعلات بروتين الحمض النووي في الأنظمة المعاد تشكيلها لتكرار الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي في المختبر. لا تنس أن العمل باستخدام محلول سمكة الضاري المفترسة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء أقنعة الوجه الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.