أسلوب حجمي للتحديد الكمي للمخ بالتشنج في نموذج موريني نزيف تحت العنكبوتية
يوليو 28, 2018
والهدف من هذه المادة هو تقديم أسلوب يسمح بإعادة بناء ثلاثي الأبعاد لشجرة الأوعية الدموية للمخ في الفئران بعد الدقيقة المحسوبة التصوير المقطعي وتحديد كميات من شرائح كامل السفينة التي يمكن استخدامها لقياس بالتشنج الدماغي في مورين نماذج من نزيف تحت العنكبوتية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد التشنج الوعائي الدماغي في الفئران ، بعد تحريض النزيف تحت العنكبوتية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إخضاع للتروية عبر القلب والصب داخل الأوعية الدموية ، باستخدام عامل صب ظليلة للإشعاع. الخطوة التالية هي الحصول على بيانات الصورة المقطعية ، عن طريق تعريض الدماغ للتصوير المقطعي بالحواسيب الصغيرة.
ثم تتم معالجة الصورة والبيانات. يستخدم برنامج Miro لإعادة بناء شجرة الأوعية الدموية داخل الجمجمة فعليا ولحساب أحجام أجزاء الأوعية الدموية المحددة ، والتي تمثل مقياسا موضوعيا لتحديد تشنج الأوعية الدموية. يحدث نزيف تحت العنكبوتية في الفئران عن طريق ثقب خيوط الأوعية الدموية تحت التخدير باستخدام الأيزوفلوران.
يتم تحضير الشريان السباتي الخارجي الأيسر جراحيا. ثم يتم إدخال خيوط في الشريان السباتي الخارجي وتتقدم داخل الجمجمة من خلال الشريان السباتي الداخلي ، والذي يتم ثقبه في الشريان السباتي t ، مما يؤدي إلى نزيف تحت العنكبوتية. يؤخذ ارتفاع الضغط داخل الجمجمة كمؤشر على نجاح الانثقاب داخل الأوعية الدموية.
لتحليل التشنج الوعائي ، قم بتحفيز التخدير. استمر فقط بعد الوصول إلى مستوى التخدير الكافي ، وهو ما يؤكده عدم وجود ردود فعل على محفزات الألم. قم بإجراء نضح عبر القلب باستخدام المحاليل التالية.
محلول ملح فسيولوجي يحتوي على التركيزات الفسيولوجية للصوديوم والبوتاسيوم والكالسيوم والمغنيسيوم عند درجة حموضة سبعة نقاط أربعة. وبعد ذلك ، حل 4٪ PFA. ابدأ الوفرة بالمحلول رقم واحد لمدة دقيقتين واستمر في المحلول الثاني لمدة أربع دقائق.
قم بنقع المحاليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واستخدم مضخة يتم التحكم فيها بالضغط بمعدل تروية متغير لنفخ ضغط ثابت يبلغ 70 ملم من الزئبق. تجنب فقدان الضغط عند التبديل من الحل الأول إلى الحل الثاني. بعد التروية بكلا المحاللين ، استمر في التروية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عامل صب ظليل للإشعاع بمعدل ثابت من نقطة ملليلتر في الدقيقة.
امسك العينة لمعالجة مادة صب الظليلة المشعة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. وقم بإزالة الدماغ وتخزين العينة عند أربع درجات مئوية في محلول 4٪ PFA حتى يتم ضبطه بشكل دقيق. ضع الدماغ في منتصف أنبوب بلاستيكي باستخدام ملقط تشريحي غير حاد.
اختر أنبوبا بقطر أكبر قليلا من العينة ، للتأكد من أن الكائن لا يتحرك أثناء الحصول على الصورة. استخدم الشاش لإغلاق الأنبوب. قم بتوصيل الأنبوب البلاستيكي من خلال محرك متدرج صغير لنظام تحديد المواقع للتحكم في الكمبيوتر في كابينة الأشعة السينية ، حيث يتم تدوير الكائن حول محوره الأفقي.
قم بمحاذاة العينة في مجال الرؤية تحت التصوير الشعاعي بالأشعة السينية. لتحقيق أقصى قدر من التكبير ، ضع الجسم في أقرب مكان ممكن من مصدر الأشعة السينية وقم بزيادة المسافة إلى الكاشف قدر الإمكان. استخدم بروتوكول الحصول على الصور خطوة والتصوير باستخدام معلمات المسح الضوئي التالية.
اضبط وقت التعرض على ثانية واحدة لكل إسقاط واستخدم جهد أنبوب يبلغ 80 كيلو فولت لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. اضبط عدد الإسقاطات على 1,000 لدورة واحدة. لإعادة بناء البيانات الأولية ، استخدم خوارزمية الإسقاط الخلفي المصفاة ، مما يعني مرشح Shepp-Logan بمصفوفة من 1 ، 024 فوكسل مكعب.
قم باستيراد بيانات dicom إلى برنامج Miro باستخدام استيراد الوظيفة. تصور شجرة السفينة باستخدام الدالة vol-run. اختر عتبة التصور بحيث يتم تصوير الشرايين الدماغية الكبيرة في مخططات حادة.
من المهم استخدام نفس عتبة التصور لجميع مجموعات البيانات التي تنتمي إلى السلسلة التجريبية. قم بتشريح الشرايين الدماغية القاعدية لدائرة ويليس تقريبا ، مع إضافة حجم وظيفة من خلال إحاطة الأوعية بالمنطقة الدقيقة. ثم قم بتشريح جزء الوعاء المراد تحليله تقريبا.
لذلك ، قم بتدوير النموذج ثلاثي الأبعاد لشجرة الأوعية الدموية من أجل فصل جميع الفروع الصغيرة بدقة عن الشريان الرئيسي. من الضروري لمزيد من التحليل حذف جميع السفن باستثناء جزء السفينة المراد تحليلها. قم بتطبيق الهيكل العظمي التلقائي للدالة مع تعيين العتبة على عتبة التصور ، والتي تنشئ خطا مركزيا ، رسم بياني مكاني قائم على الخط.
ثم قم بتطبيق الرسم البياني المكاني للدالة على مجموعة الأسطر ، لإنشاء مجموعة خطوط. قسم مجموعة الأسطر إلى مقاطع فرعية فردية عن طريق اختيار المقاطع الفرعية الفردية يدويا باستخدام المؤشر والنقر فوق التقسيم. هذه الخطوة حاسمة لحساب أحجام المقاطع الفرعية الفردية.
استخدم سطر الدالة الذي تم تعيينه على الرسم البياني المكاني لإنشاء رسم بياني مكاني مرة أخرى. استخدم إحصائيات الرسم البياني المكاني للدالة لتحديد طول وحجم وقطر كل مقطع فرعي. للتصور المرمز بالألوان ، الذي يمثل مسار قطر الوعاء استخدم عرض الرسم البياني المكاني للوظائف.
اضبط تلوين القطعة على السماكة ، والتي ترتبط بقطر الوعاء. من المهم اختيار نفس خريطة الألوان لجميع مجموعات البيانات التي تنتمي إلى السلسلة التجريبية. أضف أطوال الأجزاء الفرعية لتحديد الأجزاء الفرعية التي سيتم تضمينها في التحليل الإضافي.
في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم جزء من الوعاء الدموي يتكون من ملليمتر واحد من الشريان السباتي الداخلي ، وقريب من الشريان السباتي t ، ونقطتين خمسة ملليمترات من الشريان الدماغي البعيد للشريان السباتي. ثم أضف الأحجام لتحديد حجم الوعاء لجزء الوعاء المحدد. لتقييم دقة إعادة البناء الافتراضية لشجرة الأوعية الدموية ، أجرينا المقارنة القائمة على القطر بين أقطار الأوعية المحددة مجهريا ومن عمليات إعادة البناء الافتراضية ثلاثية الأبعاد في نقطتين محددتين تشريحيا في عشر عينات من الدماغ.
للتحديد المجهري لأقطار السفينة ، وكاميرا عالية الدقة ، وأداة معايرة برمجية ، ومقاييس ميكرومتر مستخدمة ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين الأقطار المحددة مجهريا وافتراضيا. مما يشير إلى إعادة بناء افتراضية دقيقة لتشريح الأوعية الدموية داخل الجمجمة. لتحديد التشنج القاعدي الدماغي ، حددنا حجم مقطع وعاء ممثل محدد مسبقا من ثلاث نقاط خمسة ملليمترات ، يتكون من مليمتر واحد IC8 ونقطتين خمسة ملليمترات MCA على اليسار.
في عينات الدماغ من SAH التي تم تشغيلها الوهمية. كان حجم الأوعية الدموية أقل بكثير في SAH مقارنة بالوسام ، مما يشير إلى تشنج الأوعية الدموية الدماغية. كانت أقطار السفينة أيضا أقل بكثير في SAH مقارنة بالوهم.
تعكس إعادة البناء الافتراضية التي تم تحقيقها بالطريقة المعروضة هنا تشريح الأوعية الدموية بدقة. يمكن فحص أجزاء الوعاء بأكملها ، ويفترض أن تقدم معلمة أكثر موضوعية لتحديد التشنج الوعائي من تحديد أقطار الوعاء عند نقطة واحدة. يؤدي التقييم الحجمي إلى اختلافات أكبر بين الأوعية الدموية والأوعية غير الوعائية مقارنة بتقييم أقطار الأوعية الدموية فقط.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لإعادة بناء ثلاثية الأبعاد للشجرة الوعائية الدماغية في الفئران باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتقدير حجم التشنج الوعائي الدماغي الذي يلي النزف تحت العنكبوتية. تجمع هذه التقنية بين التروية عبر القلب، والصب الوعائي الداخلي، ومعالجة الصور المتقدمة لقياس أحجام الأوعية الدموية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علوم الأعصاب
- أبحاث الأوعية الدموية الدماغية
- تقنيات التصوير
خلفية علمية
- يُعد التشنج الوعائي الدماغي مضاعفة خطيرة تلي حدوث النزيف تحت العنكبوتية.
- إن فهم الاستجابات الوعائية أمر ضروري لتطوير الاستراتيجيات العلاجية.
- يمكن لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D reconstruction) توفير رؤى حول التغيرات الوعائية وتقدير شدة التشنج الوعائي كمياً.
- قد تفتقر الطرق الحالية إلى الدقة في قياس التغيرات في الأوعية الدموية بعد الإصابة.
الغرض من الدراسة
- تأسيس تقنية موثوقة لقياس التشنج الوعائي الدماغي في الفئران.
- تحسين فهم التغيرات الوعائية الدماغية التي تلي النزف تحت العنكبوتية.
- تسهيل التقييم الموضوعي لمورفولوجيا الأوعية الدموية ووظيفتها.
الطرق المستخدمة
- استخدمت الدراسة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتصوير الجهاز الوعائي الدماغي.
- خضعت الفئران لعملية صب الأوعية الدموية عن طريق القسطرة بعد تحفيز حدوث نزيف تحت العنكبوتية.
- تضمنت الخطوات الرئيسية التروية عبر القلب باستخدام محاليل فسيولوجية وعوامل صب عاتمة للأشعة.
- تمت معالجة الصور والبيانات باستخدام برنامج Miro لتصور وتحليل هياكل الأوعية الدموية.
- تمت مقارنة القياسات الدقيقة لأقطار الأوعية الدموية بين إعادة البناء المجهري والافتراضي.
النتائج الرئيسية
- سمحت هذه الطريقة بإعادة بناء دقيقة ثلاثية الأبعاد للشجرة الوعائية داخل الجمجمة.
- لم يكن هناك فرق معنوي في قياسات قطر الأوعية بين الطرق المجهرية والافتراضية، مما يشير إلى دقة عالية.
- وفر تحليل قطاعات الأوعية مقاييس موضوعية لتقييم شدة التشنج الوعائي.
- سلطت الدراسة الضوء على أهمية توحيد عتبات التصوير لضمان الاتساق عبر مجموعات البيانات.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة طريقة جديدة ودقيقة لتقييم التشنج الوعائي الدماغي في النماذج الفأرية.
- تساهم هذه الطريقة في تعزيز القدرات على قياس التغيرات الوعائية التي تلي الإصابات النزفية.
- تحمل هذه النتائج دلالات هامة لفهم ديناميكيات الأوعية الدموية الدماغية وتطوير مناهج علاجية جديدة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال التحديد الكمي للتشنج الوعائي الدماغي في النماذج قبل السريرية يمثل تحدياً حرجاً في تطوير أدوية السكتة الدماغية، حيث تبرز الحاجة إلى مقاييس وعائية موضوعية لتقليل المخاطر المتعلقة بالفرضيات الميكانيكية ودعم قرارات المضي قدماً أو التوقف. توفر هذه الطريقة الحجمية قراءة قابلة للتكرار تعتمد على التصوير، مما يعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال الانتقال من قياسات القطر عند نقطة واحدة إلى التحليل المتكامل لقطاعات الأوعية الدموية. ويتيح تطبيقها في نماذج نزيف تحت العنكبوتية (SAH) لدى الفئران إجراء تقييم معياري للاعتلال الوعائي، مما يدعم الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التقييم قبل السريري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال توفير مقاييس حجمية موضوعية للتشنج الوعائي الدماغي كنقطة نهاية فيزيولوجية مرضية.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال إعادة بناء ثلاثية الأبعاد دقيقة للشجرة الوعائية الدماغية، مما يقلل الاعتماد على القياسات غير المباشرة أو قياسات النقطة الواحدة.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في الهدف من خلال تحديد التغيرات الوعائية كمياً عبر كامل قطاعات الأوعية، مما يحسن الارتباط بالنتائج الوظيفية في الأنظمة ذات الصلة بالمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج مخرجات كمية ومعيارية لحجم الأوعية الدموية تتيح مقارنة موثوقة بين الظروف التجريبية في نماذج التشنج الوعائي.
- القيمة التشغيلية: يؤسس سير عمل قابل للتكرار يجمع بين التروية عبر القلب، والصب الوعائي الداخلي، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) لتوصيف ظاهري وعائي متسق.
- القابلية للتوسع: يسهل إعادة استخدام المنصة عبر الدراسات المختلفة من خلال الحفاظ على عتبات تصوير وبروتوكولات تقسيم ثابتة للتحليلات الطولية أو المقارنة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة اكتشاف التكميم الوعائي والتحقق قبل السريري من خلال توفير نظام مرتبط بالمرض يحاكي باثولوجيا التشنج الوعائي السريري.
- تقليل المخاطر الآلية: يتيح تقييماً موضوعياً لشدة التشنج الوعائي، مما يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر في مسارات التطوير قبل السريرية.
- الثقة التنبؤية: يُظهر التقييم الحجمي حساسية أكبر للتغيرات التشنجية الوعائية مقارنة بالمقاييس التي تعتمد على القطر فقط، مما يحسن القيمة التنبؤية للنتائج قبل السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، مما يدعم اختبار الفرضيات في مراحل الاكتشاف المبكرة، وجاهزية المقايسة في عمليات الفحص، والتحقق من النمط الظاهري الوعائي في البحوث الانتقالية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال قياس التشنج الوعائي كاستجابة بيولوجية قابلة للقياس لنزيف تحت العنكبوتية.
- الفحص: يوفر مخرجات وعائية كمية جاهزة للمقايسة مع قابلية عالية للتكرار، مما يتيح إجراء مقارنات موثوقة بين المركبات أو الأنماط الجينية.
- التحليلات: يوفر قياسات حجمية وقياسات للطول والقطر من إحصائيات الرسوم البيانية المكانية، مما يقدم قراءات متعددة الأبعاد لمقارنة الحالات.
- الأبحاث الانتقالية: يتوافق مع الاستمرارية قبل السريرية من خلال تقديم مقاييس وعائية ذات صلة بالمرض يمكن أن تدعم تقييمات الفعالية المتوافقة مع المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة موحدة للقياس الكمي للأوعية الدموية قابلة للتطبيق عبر نماذج متعددة لإصابات الأوعية الدموية الدماغية بما يتجاوز نزيف تحت العنكبوتية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال التحديد الكمي الحجمي والموضوعي للتشنج الوعائي الدماغي.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار عبر عتبات تصوير ثابتة، وبروتوكولات تروية، وسير عمل لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد شبه الآلي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي في نمذجة التشنج الوعائي، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات المرشحين بناءً على تقييم المخاطر استناداً إلى بيانات قوية للنمط الظاهري الوعائي قبل السريري.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب الأمر خبرة في الجراحة المجهرية، وتقنيات التروية، وتشغيل التصوير المقطعي المحوسب المجهري (micro-CT) لضمان نجاح صب الأوعية الدموية وتصويرها.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى أنظمة التصوير المقطعي المحوسب المجهري وبرمجيات التصور ثلاثي الأبعاد (مثل Miro) للحصول على الصور وتحليلها.
- يستلزم توحيد معايير عتبات التصور وبروتوكولات التقسيم بين الفرق لضمان الاتساق عبر المجموعات التجريبية.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق الطريقة على قطاعات وعائية مختلفة أو أنظمة نماذج متنوعة، ويتم التحقق من ذلك من خلال فحوصات الدقة القائمة على القطر.
- يقتصر هذا التحليل بكونه يتم خارج الجسم (ex vivo)، مما يسمح برصد المورفولوجيا الوعائية النهائية ولكن ليس تطور التشنج الوعائي الديناميكي في الوقت الفعلي.
