النمذجة سليكون متشابك مع 3D كوكولتوريس أستروسيتيس والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب فيما يتعلق بكيفية مساهمة الاتصال بين الخلايا بين أنواع الخلايا العصبية البشرية المتعددة في تكوين الدوائر المشبكية ووظيفتها. تولد هذه التقنية بسرعة وبشكل منهجي مجالات الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد من الخلايا النجمية الناضجة وظيفيا والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. يمكن استخدامها للتحقيق التجريبي الصارم.

تعد قابلية التكرار وقابلية التوسع لهذا البروتوكول بديلا محددا للتقنيات العضوية الناشئة. تظهر هذه نتائج وعدة بتطوير أدوية جديدة وعلاج النقش الخلوي لتعزيز التجدد العصبي بعد الإصابة أو المرض. ابدأ بتثبيت مجموعات من HPSCs في ملليلترين من وسط HPSC الذي يحتوي على مثبط rho-kinase Y-27632 في كل بئر من صفيحة ستة آبار مطلية ب ECM.

حافظ على الخلايا الجذعية حتى تصبح حوالي 50٪ ملتقية ، ثم قم بتغيير الوسط إلى الوسط العصبي الذي يحتوي على SB431542 و DMH1 لتعزيز الحث العصبي. عندما تكون الخلايا حوالي 95٪ ملتقية ، قم بتقسيم كل بئر من واحد إلى ستة إلى آبار جديدة مطلية ب ECM. في اليوم 14 ، قم بفصل الخلايا بمحلول الانفصال ، وانقل محتويات كل بئر إلى قارورة T25 غير مطلية بوسط يحتوي على Y-27632 لتعزيز تكوين الركام.

لتوليد أسلاف الخلايا النجمية والخلايا النجمية في مجاميع ثلاثية الأبعاد متكونة تلقائيا ، قم بالتبديل إلى الوسط العصبي الذي يحتوي على EGF و FGF2 ، وتغذي كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى يتم تأكيد هوية الخلايا النجمية في أربعة إلى ستة أشهر. بشكل افتراضي ، ينتج هذا البروتوكول الخلايا النجمية القشرية الظهرية. ومع ذلك ، يمكن تحديد الأنواع الفرعية للخلايا النجمية إقليميا عن طريق إضافة مورفوجينات الزخرفة ، إذا رغبت في ذلك.

مرة واحدة في الأسبوع ، عندما تظهر المراكز المظلمة ، اجمع الكرات عن طريق الطرد المركزي ، ثم قم بفصل مجاميع H-astro برفق بمحلول الانفصال. قم فقط بإعادة طلاء تلك المجالات التي لا ترتبط تلقائيا لتجنب مرور الخلايا غير العصبية وغير العصبية. بعد أربعة إلى ستة أشهر من التوسع ، تأكد من هوية الخلية إما في وسط التجميد والحفظ بالتبريد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، أو استخدمه على الفور للتجريب.

لتوليد أسلاف الخلايا العصبية غير المعدلة وراثيا في الخلايا العصبية ، أو الخلايا العصبية H ، الأسلاف العصبية المشتقة من HPSC في اليوم 14 في صفائح من ستة آبار مطلية ب ECM مع ملليلترين من الوسط العصبي و Y-27632 لكل بئر. إذا كنت تعمل مع iNeurons المحفزة للدوكسيسيكلين ، أضف وسيطا عصبيا يحتوي على الدوكسيسيكلين عندما تكون الخلايا حوالي 35٪ ملتقية للحث على التمايز وتنشيط التعبير الجيني. بعد يومين ، قم بتغذية الخطوط المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا بملليلترين من الوسائط العصبية لكل بئر في اليوم.

استمر حتى تصبح الخلايا جاهزة للرفع عند التقاء 70٪. بالنسبة للزراعة المشتركة ، قم أولا بفصل H-astros برفق عن المجاميع ثلاثية الأبعاد بمحلول الانفصال. ثم انتقل إلى فصل الخلايا العصبية H ، أو iNeurons ، من طبقة أحادية ثنائية الأبعاد.

أولا ، قم بإزالة الوسط من اللوحة المكونة من ستة آبار ، وأضف 500 ميكرولتر من محلول الانفصال إلى كل بئر يحتوي على ثقافات أحادية الطبقة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، أضف برفق ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من وسط DMEM-F12 لإزالة الخلايا المرفقة.

بعد ذلك ، اجمع الخلايا في وسط في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة دقيقة واحدة. قم بشفط المادة الطافية ، وأضف ملليلترا واحدا من الوسط الطازج ، وقم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل برفق باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 ، 000 ميكرولتر للحصول على تعليق أحادي الخلية. عد كل نوع من أنواع الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.

أضف النسبة المطلوبة من الخلايا العصبية H-astros و H المنفصلة ، أو iNeurons ، بحجم إجمالي قدره ملليلترين لكل بئر من الصفيحة الدقيقة. الطرد المركزي للوحة عند 100 مرة G لمدة ثلاث دقائق ، والعودة إلى الحاضنة لمدة يومين. بعد يوم واحد ، يجب أن تتشكل كريات مجهرية كثيفة في اللوحة.

استخدم ماصة صغيرة سعة 1,000 ميكرولتر لإزالة الكرات برفق من الآبار الصغيرة. قم بتطبيق القوة برفق على قاع الآبار الصغيرة ذات الوسط لإزالة أي كرات إضافية ملتصقة. بعد جمع جميع الكرات في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، اتركه ليستقر.

ثم اغسل الكرات عن طريق شفط الوسط القديم أولا ، ثم إضافة ملليلترين على الأقل من الوسط الطازج. أضف الكرات إلى قارورة دوارة تحتوي على 50 إلى 60 مل من المتوسط. ضع القارورة في الحاضنة على لوح تحريك مغناطيسي على 60 دورة في الدقيقة.

هناك حاجة إلى ما لا يقل عن ثلاثة أسابيع في الثقافة لتكوين المشبك العصبي. ابدأ بطلاء سطح كل مجموعة متعددة الأقطاب الكهربائية ، أو MEA ، بملليلتر واحد من البولي أورنيثين لجعل السطح محبا للماء ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد الحضانة ، قم بإزالة البوليورنيثين ، واغسل سطح كل MEA بالماء منزوع الأيونات.

ثم أضف ملليلترا واحدا من المصفوفة خارج الخلية ، والعودة إلى الحاضنة لمدة لا تقل عن أربع ساعات. عندما تصبح جاهزا ، قم بإزالة المصفوفة خارج الخلية ، ثم ضع الكرات في 1.5 مل من الوسط على سطح MEA ، مع التأكد من وضع الكرات أعلى مجموعة القطب. اتركيه يلتصق لمدة يومين.

لقياس النشاط الكهربائي للمجالات العصبية ، ضع MEA على مرحلة رأس يتم التحكم في درجة حرارتها. استخدم مرشح التمرير العالي بخمسة هرتز ، ومرشح التمرير المنخفض 200 هرتز ، وعتبة ارتفاع خمسة أضعاف الانحراف المعياري ، لتسجيل النشاط الكهربائي التلقائي. احفظ البيانات الأولية ، بما في ذلك تردد الارتفاع والسعة للتحليل الإحصائي.

تظهر علامات البروتين المقيدة من نوع الخلايا العصبية ، مثل MAP2 للخلايا العصبية و GFAP للخلايا النجمية ، بصريا الترتيب والنضج المتساوي للخلايا النجمية في الخلايا العصبية داخل المجالات ثلاثية الأبعاد. يظهر الحد الأقصى من الإسقاط لتشكل الخلايا النجمية والتفرع في كرة ثلاثية الأبعاد تمثيلية مع H-astros المسمى بشكل ضئيل باستخدام GFP المرتبط بالغشاء. علامات H-astros الناضجة بما في ذلك GFAP.

على الرغم من أن iNeurons تعبر عن بروتينات ما قبل وبعد المشبكي ، كما هو موضح في الصورة على اليسار ، إلا أن الكثافة المشبكية تتعزز بشكل كبير من خلال وجود H-astros والزراعة المشتركة. أثناء التسجيلات ، ستثير المجالات الصحية من iNeurons الموضوعة على MEAs تلقائيا ارتفاعات في الجهد أكبر من 40 ميكروفولت مع ترددات إطلاق ثابتة. تعرض مجالات الزراعة المشتركة اتصالا أكبر بالشبكة مع وجود H-astros ، مما يؤدي إلى زيادة رشقات الشبكة المتزامنة من الارتفاعات.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الكالسيوم من أجل قياس الاستجابة الفسيولوجية للخلايا النجمية للنشاط المشبكي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الزرع في نماذج حيوانية للتحقيق في الاتصال بالدوائر المشبكية الموجودة مسبقا. باتباع نهج الهندسة الحيوية هذا ، يمكن للمرء دمج المواد الحيوية خارج الخلية وأنواع الخلايا الإضافية مثل الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا الدبقية الصغيرة ، والخلايا الإثيلية بنسب محددة من أجل نمذجة الإشارات المعقدة التي تحدث في الدماغ.