تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1^-/-

أثناء عدوى فيروس زيكا، يمكن للخلايا التائية اختراق الأعضاء المناعية للقضاء على الفيروس ولكنها قد تساهم أيضًا في الإصابة بالمناعة، مثل متلازمة غيلان باريه أو إصابة الخصية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل الكشف القائم على رباعيات الحساسية للخلايا التائية الخاصة بمضادات المضادات في الأعضاء المحرومة من المناعة، سواء أثناء عدوى فيروس زيكا أو بعد التطعيم باللقاحات. في هذا النموذج، بدأت عدوى فيروس زيكا في فئران خروج المغلوب مستقبلات ألفا/بيتا، مما يسمح بتتبع الخلايا التائية الخاصة بفيروس زيكا في الدماغ والخصيتين والطحال.

باستخدام نهج التلطيخ رباعية المامر، من الممكن التحقيق في خصائص فقط من الجهاز المناعي الذي يتسلل الخلايا التائية لفيروس زيكا لاستكشاف مساهمات الخلايا التائية في الخلايا المناعية والخلايا المناعية. بالنسبة للعدوى بفيروس زيكا، قم بتسليم 10 مرات لوحدات التركيز الأربع من فيروس زيكا في 100 ميكرولتر من PBS عن طريق التطعيم المداري الرجعي إلى فئران خروج المغلوب من مستقبلات الإنترفيرون ألفا/بيتا التي تبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع. ثم، مراقبة الوزن والعلامات السريرية للحيوانات المصابة يوميا لمدة 15 يوما.

سبعة أيام بعد التلقيح، وتأمين الحيوان المصاب في موقف سوبين على رغوة جراحية، واستخدام مشرط معقمة لجعل شق الجلد على طول خط الوسط من البطن. استخدم المقص لفتح عضلات البطن، واستخراج الكبد بلطف. ثم، وإزالة الطحال، وشطف الأنسجة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لإزالة الدم.

بعد الغسيل الأخير، ضع الطحال على 1.5 ملليلتر من الجليد البارد في الـ RPMI على الجليد حتى يتم جمع جميع الطحالات. لتوليد تعليق خلية واحدة، ووضع الطحال في معقم، 40 ميكرومتر شبكة مصفاة الخلايا على رأس أنبوب 50 ملليلتر، وإضافة ملليلتر من الجليد الباردة RPMI المتوسطة تستكمل مع مصل البقر الجنين 10٪، أو FBS، إلى مصفاة. ثم، استخدام المكبس من حقنة خمسة ملليلتر لmacerate الأنسجة من خلال مرشح، وذلك باستخدام المتوسطة الطازجة لطرد الخلايا المفرج عنها من خلال شبكة.

نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمس ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة. بعد خمس إلى ست دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف التحلل مع 10 ملليلتر من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS للطرد المركزي الثاني، وإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من المتوسط الكامل للعد. سبعة أيام بعد التطعيم، وشل حركة القتل الرحيم، المصابة، والفأر الذكور في موقف عرضة على لوحة القطع، وتأمين فروة الرأس مع ملقط مستقيم واحد في اثنين من الأسنان.

استخدم مقص القزحية لإجراء شق في منتصف الطريق على فروة الرأس ، مما يعرض الجمجمة ، واستخدم ملاقط حادة لتضييق جانبي المدارين مع ملاقط حادة ، وتحديد الدماغ. وضع طرف واحد من مقص القزحية الحادة في ماغنوم السفح، وقطعاً بشكل جانبي إلى الجمجمة على كل جانب. قطع بعناية من نفس تجويف خط الوسط، نحو الأنف، والحفاظ على نصائح مقص سطحية قدر الإمكان لتجنب إصابة الدماغ.

ارفع الدماغ باستخدام ملقط، واستخدم مقص القزحية الحاد لتشريح الألياف العصبية القحفية بعناية. ثم، استخدام ملقط لنقل الدماغ إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS. لعزل الخصية ، ارفع جلد البطن بالملقط ، واستخدم مقص القزحية لإجراء شق طولي من خلال الجدار البطني والبطن وفضح الجزء السفلي من البطن.

ادفع الخصيتين حتى الشق، واستخدم ملاقط لسحب طبقة الدهون برفق، لفضح الخصيتين الزُنية على كلا الجانبين. استخدام مقص القزحية لتشريح بعناية طبقة الدهون وepdidymis، ونقل الخصيتين إلى أنبوب 15 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS. لتوليد تعليق من خلية واحدة من أي من الأنسجة المحصودة، ضع العضو على مصفاة خلية معقمة مع شبكة 100 ميكرون فوق أنبوب 50 ملليلتر، وإضافة ملليلترين من الجليد البارد RPMI بالإضافة إلى FBS إلى المصفاة.

باستخدام المكبس من حقنة خمسة ملليلتر ، هرس الأنسجة ، وغسل الفلتر مع المتوسطة الطازجة حتى تم الجهاز الأرض تماما من خلال شبكة. نقل تعليق وحيد الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من 30٪ كثافة المتوسطة الانحدار. طبقة بعناية حل الخلية على مليلترين من 70٪ كثافة المتوسط التدرج في أنبوب جديد 15 ملليلتر، وفصل الخلايا حسب كثافة الطرد المركزي الانحدار.

ثم, نقل الخلايا من interphase بين التدرجات كثافة اثنين إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر التي تحتوي على 10 ملليلتر من 10 10 milliliters من 10 10 المليلتر من 10 10 ملليمترات من 10 10 المدى البارد من المدى المنخفض 10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 لتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق، قم بتخفيف الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الست لكل 100 ميكرولتر في تركيز المخزن المؤقت FACS، واحتضان عينات الخلايا مع 10 ميكرولترات من مضادة مضادة للماوس CD16/CD32 حظر الأجسام المضادة لكل عينة. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، إضافة 20 ميكرولترات من الخلايا إلى العدد المناسب من الآبار من 96 بئرا، لوحة مستديرة القاع وفقا لبروتوكول التلط الحراري التدفقي، وإضافة 20 ميكرولترات من مزيج رباعيات البروتين E إلى كل بئر لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

في نهاية الحضانة، إضافة الأجسام المضادة سطح الخلية من الفائدة إلى الخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولترات من مخزن FACS لكل غسل، ونظف الخلايا بعناية في كل بئر مع 200 ميكرولترات من عازلة FACS الطازجة. ثم، تخزين العينات في أربع درجات مئوية، محمية من الضوء، حتى تحليلها على مقياس تدفق.

وُحظت أعراض وعلامات مرضية مثل النخاع الكلوي و paraparesis الحركية في مستقبلات الإنترفيرون ألفا/ بيتا 1 فئران بالضربة القاضية سبعة أيام بعد التطعيم مع فيروس زيكا. تم رصد التغيرات في الوزن في مستقبلات الإنترفيرون ألفا / بيتا المصابة 1 الحيوانات بالضربة القاضية لمدة 15 يوما، مع فقدان الوزن لوحظ لأول مرة بعد أربعة أيام من العدوى واستعادة الوزن ابتداء من اليوم السابع بعد العدوى. تكشف الصور التمثيلية لأدمغة المورين المصابة عن وذمة واضحة وفرط الدم لمدة سبعة أيام بعد التطعيم بفيروس زيكا.

تظهر الصور التمثيلية للخصيتان المصابة بـ murine Zika تقلصًا تدريجيًا من اليوم السابع إلى 30 يومًا بعد العدوى. كما يوضح التحليل النسيجي للدماغ المصاب بزيكا وأقسام أنسجة الخصية تأثير التغيرات المرضية المدمرة مقارنة بالضوابط غير المصابة. وكما هو متوقع من التحليلات الكلية والهوسولوجية، يتم أيضاً الكشف عن الأحمال الفيروسية العالية في الدماغ وخصي الفئران المصابة بفيروس زيكا عن طريق الكبت المناعي.

ويرافق ذلك تسلل قوي لخلايا T-T إيجابية من CD3 إلى عدوى الدماغ بعد زيكا. يتم الكشف عن الخلايا الليمفاوية T T المصابة بفيروس زيكا واللقاحات التي تم تطعيمها باللقاحات بواسطة تلطيخ رباعي البروتين الإلكتروني. كما يمكن اكتشاف خلايا T إيجابية CD8-CD-1 في الدماغ، وهي تُختبر سبعة أيام بعد التلقيح بفيروس زيكا.

بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في دراسة توصيف الخلايا التائبية الخاصة بعوامل الأمراض في الأعضاء ذات المناعته المناعية أثناء العدوى الطبيعية في النماذج الحيوانية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضا على الأجهزة الأخرى التي تنتشر في المناعة، مثل المشيمة أو العين، وكذلك على كل من العدوى الفيروسية والسرطان. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام رباعيات MHC-I للكشف المناعي الكيميائي أو المناعي من الخلايا التائية للأمراض للوصول إلى توزيع خلايا التائية المخ أو الخصيتين المتسللة.