أسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثي الأبعاد

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة وسهلة تعتمد على العفن لإنشاء أنسجة قلبية ثلاثية الأبعاد ، والتي تستخدم الفيريات كأداة لإنشاء أنسجة القلب الحرة للسقالات. في تجاربنا ، تم عزل ثلاثة أنواع من الخلايا ، والخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان ، والخلايا الليفية القلبية البشرية ، والخلايا البطانية للوريد السري البشري واستخدامها لتوليد تعليق الخلية. مع 70٪ خلايا عضلة القلب ، و 15٪ الخلايا الليفية ، و 15٪ الخلايا البطانية ، في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

ثم نقوم بتوزيع تعليق الخلية في كل بئر من نظام إسقاط معلق منخفض للغاية ، مما سيؤدي إلى تكوين تلقائي لمئات الكرات الكروية المضبوطة بعد ثلاثة أيام. ثم يتم حصاد الكرات الكروية ووضعها في تجويف قالب جديد. ثم يتم الاحتفاظ بالأنسجة في وعاء معقم مع وسيط ، على شاكر في الحاضنة لعدة أيام.

تتم إزالة القالب لاحقا ، مما ينتج عنه رقعة أنسجة خالية من السقالات ذات السلامة الميكانيكية. جهاز الإسقاط المعلق عبارة عن ملحق قابل لإعادة الاستخدام ومنخفض للغاية مع 850 مسامية صغيرة ، يبلغ قطر كل منها 350 ميكرون. القطرة المعلقة متوافقة مع ستة ألواح آبار قياسية.

بعد عمل تعليق الخلية ، نقوم بتوزيع أربعة ملليلتر من تعليق الخلية الذي يحتوي على 10 ملايين خلية ، لكل بئر من نظام الإسقاط المعلق. يتم زراعة الأجهزة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بعد 72 ساعة لوحظ تكوين تلقائي للكرات الكروية النابضة ، بمتوسط قطر 350 ميكرون.

يتم حصاد الكرويات عن طريق وضع جهاز الإسقاط المعلق في طبق آخر متوسط ، والدوران برفق لتحرير الكرات والسماح لها بالانجراف عبر المسام الموجودة أسفل نظام الإسقاط المعلق. هذا هو الرسم التخطيطي للقالب الجديد لإنشاء أنسجة قلبية ثلاثية الأبعاد وخالية من السقالات. ويشمل حصيرة المناولة وقاعدة التعبئة والقالب الجديد.

يتكون القالب الجديد من قاعدة ، ولوحة مربعة سفلية ، وشبكة سفلية ، و 10 طبقات من الشباك الجانبية المصنوعة من شوكات الفولاذ المقاوم للصدأ الدقيقة. شبكة علوية ، لوحة مربعة علوية ، أنابيب تثبيت ، ودبابيس سدادة. يمكن لنظام Novel Mould إنشاء أحجام مختلفة من الأنسجة ، بما في ذلك اثنين في ملليمترين ، وأربعة × أربعة ملليمترات ، وستة × ستة ملليمترات.

يتم تكديس اللوحة المربعة السفلية السفلية والشبكة السفلية ومحاذاتها باستخدام أعمدة الزاوية. ثم يتم تكديس 10 طبقات من الشباك الجانبية في اتجاهات متناوبة لإنشاء شبكة من الشوكات المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، بمساعدة زوج من الملقط المعقم. ثم يتم شطف قاعدة التعبئة بمحلول عازلة الفوسفات 1X ، أو PBS ، لتقليل التوتر السطحي قبل وضع الكرات في القالب الجديد.

بعد ترطيب تجويف العفن الجديد في نفس الميثان ، يتم وضع الكرات في التجويف المفترض مسبقا بالحجم المطلوب. عند الجلوس ، يتم تصريف الوسط الزائد من خلال القالب الشبكي ، مما يسمح للكرات بملء واتخاذ شكل التجويف المحدد مسبقا. ثم يتم تجميع الشبكة العلوية واللوحة المربعة العلوية على أعمدة الزاوية ويتم تثبيت دبابيس السدادة وأنابيب التثبيت ، لمنع غسل الكرويات.

يتم نقل نظام القالب الجديد المملوء إلى صفيحة من ستة آبار ، مع ستة ملليمترات من الوسط المكمل B-27 ، ثم يتم الاحتفاظ به في الحاضنة على شاكر متأرجح لمدة سبعة إلى عشرة أيام ، عند 30 إلى 40 دورة في الدقيقة. يمكن تغيير مدة الحضانة ، اعتمادا على حجم رقعة القلب. بعد الحضانة ، يتم إخراج النظام وإزالة أنبوب الإمساك والسدادات واللوحة المربعة العلوية والشبكة العلوية.

ثم تنزلق الشبكات الجانبية ذات الطبقات بعناية واحدة تلو الأخرى ، مع الحرص على عدم تعطيل الأنسجة. بعد إزالة جميع الشباك الجانبية ، يتم الحصول على رقعة قلبية سليمة أعلى الشبكة السفلية. لوحظ الضرب المتزامن الوظيفي في غضون 24 ساعة.

هذه الطريقة الجديدة القائمة على القالب هي طريقة فعالة وسهلة لإنشاء أنسجة قلبية خالية من السقالات ثلاثية الأبعاد ، بأقل جهد يدوي. تتكون الأنسجة متعددة الطبقات الناتجة من كرويات منصهرة ذات سلامة هيكلية مرضية وسلوك ضرب متزامن. تقدم هذه الطريقة الجديدة القائمة على القوالب بديلا فعالا من حيث التكلفة وقابلا للتطوير لطرق التصنيع الحيوي الحالية للأنسجة الهندسية.