إنشاء وتحليل لشريحة الورم Explants كشرط مسبق للاختبار التشخيصي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحوث قبل الإكلينيكية ، حيث قد تخدم دراسات الاستجابة للأدوية في الخلايا الجرّة للورم أغراضًا تشخيصية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن يمكن لشريحة explants نافذة قصيرة من الزمن نموذج البيولوجيا المعقدة للأنسجة الأصلية بما في ذلك وظائف موزعة مكانيا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في استخدام شرائح من أورام الرئة مورين، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنواع الأنسجة الأخرى بما في ذلك الأنسجة البشرية.

للبدء، وإعداد هزاز وتنفيذ VibraCheck وفقا للتعليمات الواردة في الدليل. ثم ملء كل بئر من لوحة 24-جيدا مع ملليلتر واحد من حل الملح المتوازن هانك تكملها البنسلين وstreptomycin والحفاظ على لوحة على الجليد. إدراج الإبر 25 قياس في جميع الكفوف الأربعة من الماوس القتل الرحيم وضعت على غطاء الستايروفوم بحيث يتعرض الصدر وتمدد الحيوان.

رش 70٪ الكحول على سطح الجلد المكشوف. استخدم المقص الموضوع في موضع الزاوية لقطع الجلد من البطن نحو الصدر وإلى منطقة الرقبة. تمدد الجلد على كلا الجانبين باستخدام ملقط وأدخل إبر قياس 25.

قطع فتح منطقة البطن. ثم قطع فتح القفص الصدري والحجاب الحاجز لفضح الرئة والقلب. كشف القصبة الهوائية عن طريق قطع بعيدا الأنسجة المحيطة بها.

تشريح الرئتين، جنبا إلى جنب مع القلب. ضع الأنسجة في أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 30 ملليلتر من الجليد البارد HBSS مكمّل مع Pen-Strep وضع على الجليد والمضي قدما إلى الخطوة التالية في أسرع وقت ممكن. الآن نقل الرئتين الحاملة للورم إلى لوحة زراعة الأنسجة 10 سنتيمترات.

استخدام مقص معقمة والملقط لفصل فصوص الرئة وتحديد فصوص مع الأورام على السطح لشرائح. ضع فص الرئة مع نسيج الورم على قطعة من ورقة التصفية لتجنب الانزلاق وقطع جزء من الرئة العادية أو نسيج الورم إضافية التي تحيط بالورم باستخدام مشرط عقيم لتوليد سطح قطعة الأنسجة المسطحة. تراجع الجانب المسطح في قطرة من مادة السيانواكريلات لاصقة وجبله على حامل العينة هزاز بحيث يواجه الورم شفرة في وضع مستقيم، والسماح لها الجافة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

ضع حامل العينة الاهتزازية في علبة العازلة المعدنية. املأ الصينية بـ HBSS الباردة المكملة بالقلم العقدي حتى تغمر الأنسجة في المخزن المؤقت. غطي صينية العازلة بغطاء Plexiglas الذي يتم توفيره مع الأداة ووضع الدرج في حمام جليدي أبيض وإضافة الثلج للحفاظ على برودة الأنسجة أثناء التقطيع.

إرفاق حمام الجليد الأبيض إلى هزاز. ثم حدد إعدادات التقطيع المناسبة وابدأ في التقطيع. جلب شفرة هزاز إلى موقف تشريح وتعيين نافذة تشريح.

استخدام ملقط العقيمة لجمع شرائح في لوحة 24-well مليئة بميليلتر واحد من HBSS تكملها القلم-سترب في بئر والحفاظ على الجليد. مع الحفاظ على تتبع من أجل تشريح، علامة كل بئر من لوحة 24-جيدا وفقا للخطة التجريبية. جمع شريحة الأنسجة المجاورة لشرائح مثقف كساعة صفر أو مرجع غير مثقف.

جمع ما لا يقل عن ثلاث شرائح مرجعية لتمثيل أعلى، مركز وأسفل الأنسجة. وبمجرد الانتهاء من تشريح، والاستمرار في تحديد وتجهيز. بعد ذلك، إعداد لوحة ستة بئر تحتوي على 2.5 ملليلتر من الثقافة المتوسطة في البئر عن طريق وضع شبكات التيتانيوم في ذلك.

تأكد من عدم تشكيل فقاعات الهواء بين شبكة التيتانيوم والمتوسطة. لتحميل شريحة على الشبكة الحفاظ على لوحة ستة جيدا في وضع الزاوية بحيث يغطي جزء من المتوسطة الشبكة. ثم ضع الشريحة في الوسط على الشبكة واستخدم ملقط لنشرها.

بعد وضع الشرائح، قم بتحميل لوحات الآبار الستة على وحدة الحضانة الدورية الموضوعة داخل حاضنة مرطبة يتم صيانتها عند 37 درجة مئوية مع 95٪ 02 و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بدء دورة التناوب. للزراعة على المدى الطويل تجديد المتوسطة الثقافة كل يوم باستخدام ملقط العقيمة لرفع الشبكة التي تحتوي على شرائح الأنسجة ووضعها في بئر فارغة من لوحة ستة جيدا.

استبدال 70٪ من المتوسطة مع ثقافة جديدة المتوسطة ووضع الشبكة مرة أخرى في. متابعة دورة التدوير كما كان سابقاً. لعلاج المخدرات على شرائح الورم إضافة 2.5 ملليلتر من وسائل الإعلام مع المخدرات المخفف أو السيطرة على السيارة في لوحة ستة جيدا.

ضع شبكات التيتانيوم في الآبار ثم ضع الشرائح على الشبكات كما كان عليه في السابق. بعد إجراء العلاجات لمدة 24 ساعة، استمر في التثبيت والمعالجة. لبدء تحديد الشريحة المطلوبة نقل بعناية باستخدام ملقط في لوحة 10 سنتيمترات تحتوي على ورقة مرشح غارقة مليئة برنامج تلفزيوني ملليلتر 2-3 والسماح لها تطفو.

ثم ارفع ورق التصفية مع زوج من ملقط وضعه في كاسيت هستو. نقل ورقة عامل التصفية إلى كاسيت هستو. إضافة قطرة من الهماوكسيلين المخفف على رأس شريحة الأنسجة للاحتفال موقف شريحة للخطوات اللاحقة.

أغلق الكاسيت، ثم قم بنقله إلى 4٪ حل buffered buffered 4٪ وترك بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد غسل ومعالجة الكاسيت كما هو موضح في البروتوكول، افتح كاسيت الهستو واستخدم مشرطًا لرفع الشريحة الثابتة بعناية من ورق التصفية. تجاهل ورقة التصفية ونقل شريحة إلى قالب يحتوي على البارافين السائل.

استخدام الوزن المسطح للضغط على الأنسجة ضد الجزء السفلي من القالب تضمين لضمان حتى قسم. ضع الجزء السفلي من كاسيت histo على رأس القالب. إضافة البارافين السائل على أعلى منه.

ودع القالب يبرد على طبق بارد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك فصل العفن المبرد من كتلة البارافين. استخدام microtome لإعداد أربعة ميكرومتر أجزاء رقيقة من كتل شريحة الأنسجة FFPE.

تقليم بعيدا عن فائض من البارافين المحيطة الأنسجة. للحصول على أقسام حتى في جميع أنحاء الأنسجة ضبط زاوية كتلة بحيث سطح كتلة هو اتجاه أفقيا فيما يتعلق شفرة. باستخدام فرشاة رقيقة جمع أقسام الأنسجة المتتابعة من شريحة الأنسجة البارافين جزءا من بدءا من الجزء العلوي من الشرائح الزجاجية.

مواصلة جمع أقسام من طبقات الأنسجة أعمق إلى الوسط، تليها الجزء السفلي من الشرائح الزجاجية. يتم تجميع المقاطع من طبقات مختلفة من كل شريحة نسيج إلى شرائح الكائن لتمكين التقاط التدرجات التي تسببها الثقافة المحتملة في قابلية البقاء أو ترحيل الخلايا أو التعبير العلامات الحيوية. بعد جمع الأقسام مواصلة تجهيزها ومزيد من التحليل على النحو المبين في البروتوكول.

يمكن أن يؤثر سمك شريحة الأنسجة على صلاحية الشرائح المستزرعة. في هذه الحالة، تظهر شرائح سميكة 250 ميكرومتر زيادة التدرجات النخر بالمقارنة مع شرائح سميكة 200 ميكرومتر بسبب شرائح أكثر سمكا تصبح عرضة لنقص في الأكسجين أو نشر المغذيات عبر الشرائح. ومع ذلك، تحتوي شرائح رقيقة 160 ميكرومتر على مناطق نخرية كبيرة ربما يكون سببها المعالجة التقنية أثناء تحديد المواقع من الشرائح لأن هذه هي هشة وتميل إلى حليقة.

تحليل NKX2-1، علامة على سرطان الرئة المتمايزة جيدا، ويبين أن التعبير لا يتغير بشكل كبير في شرائح مثقف بالمقارنة مع شرائح صفر ساعة غير ثرثرة. كما أكد التحليل الكمي للتعبير NKX2-1 أن التعبير لم يتغير بشكل كبير في الشرائح المستزرعة مقابل الشرائح غير المُزَوَّجة، مما يشير إلى أن عملية الزراعة لا تؤثر بشكل واضح على حالة التمايز في أنسجة الغدة السرطانية. لاختبار ما إذا كان يمكن استخدام شرائح أنسجة الورم لتقييم فعالية الأدوية المستهدفة ، تم علاجها مع DMSO أو كميات من المركبات.

عندما تعامل مع dactolisib واحد من الميكرومولار الذي يستهدف مسالك mTOR تم تثبيط 4EBP1. 0.5 سيلوميتينيب ميكرومولار الذي يستهدف مسار كيناز MAP كان فعالاً في تثبيط فسفور ERK1/2. بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية العمل مع وتحليل شرائح قطع طازجة من أنسجة الورم الثمينة.

ساهم لدينا ما بعد الدكتوراه السابقة، كاتيا ناري، بشكل كبير في تأسيس هذه الطريقة بالتعاون مع الزملاء في منصة شريحة الأنسجة IMI Predect Consortium.