استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الكيميائية واكتشاف الأدوية. مثل, هل مركبك ربط البروتين الهدف? المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنه لا يوجد شرط من انفصال الخلايا المتصونة.

ويمكن تحديد التوطين المكاني عن طريق التصوير. على الرغم من أننا قد طبقت هذه الطريقة في خطوط الخلية، فمن الممكن أيضا لتطبيق هذه الطريقة لأنظمة الخلايا الأخرى مثل الثقافات الأساسية والثقافات المشتركة. قبل بذر الخلايا، ضع لوحات فحص سوداء 384 بئرًا في غطاء لثقافة الأنسجة، واغطي اللوحات بورق الألومنيوم قبل استخدام حفر قياسي لإجراء ثلاثة ثقوب قطرها 3.5 ملليمتر على طرفي كل لوحة.

عندما تكون اللوحات جاهزة، استخدم تقنية معقمة لغسل ثقافة الخلايا A-431 مع 5 إلى 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. واحتضان الخلايا مع مليلترين من التربسين في 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا. بعد العد، وتمييع الخلايا إلى 5 مرات 10 إلى الخلايا 4 لكل ملليلتر في المتوسطة الثقافة، والبذور 40 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من كل لوحة المقايسة.

يهز بلطف كل لوحة من جانب إلى آخر بعد البذر لضمان توزيع متجانس للخلايا عبر قيعان البئر. لتقليل تأثيرات حافة اللوحة، السماح للخلايا بالاستقرار في الجزء السفلي من لوحات الفحص لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الجزء الخلفي من غطاء تدفق الفلام قبل وضع اللوحات في غرفة مرطبة مخصصة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في يوم التجربة، استخدم غسالة لوحة لpirate المتوسطة من كل بئر.

وإضافة 30 ميكرولترات من مركب الفائدة في التركيز التجريبي المناسب إلى الآبار التجريبية المناسبة. ختم لوحات الفحص المعالجة بالمركب بأختام لوحة تنفس. وإرجاع اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة.

لفضح الخلايا لتحدي الحرارة، تعيين حمام الماء أولا إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة، ووضع لوحة وهمية غير المخاين التي تحتوي على نفس حجم المتوسطة في كل بئر لوحة المقايسة في الحمام، جنبا إلى جنب مع ميزان الحرارة الحرارية لرصد درجة الحرارة داخل الآبار. عندما تم الوصول إلى درجة الحرارة التجريبية المناسبة، وإزالة ختم تنفس من كل لوحة المقايسة وإعادة ختم لوحات مع رقائق الألومنيوم لاصقة ضيقة لضمان عدم تسرب المياه في الآبار خلال التدفئة اللاحقة في حمام الماء. الحفاظ على الثقوب المحفورة داخل إطار اللوحة يمكن الوصول إليها.

ضع لوحات الفحص ولوحة وهمية جديدة في حمام الماء ، مع قيعان الصفائح الزاوية نحو سطح الماء لإجبار أي هواء متبقي من تحت الألواح ، والبدء في مراقبة درجة حرارة اللوحة الوهمية الجديدة. التدفئة حتى من لوحة أمر بالغ الأهمية لأداء الفحص. الحرص على وضع لوحة في حمام الماء بحيث لا توجد فقاعات الهواء المحاصرين تحتها.

بعد ثلاث دقائق، على الفور تبريد لوحات في حمام ماء ثان من المياه درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل تحليلها. لتصوير الخلايا، أولا إضافة 10 ميكرولترات من 16٪ شبهformaldehyde مباشرة إلى لوحات فحص لاحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التثبيت، وغسل الخلايا مع 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني على غسالة لوحة، وإضافة 20 ميكرولترات من 0.1٪NP40 لاحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، وغسل الخلايا كما هو موضح. وحجب الخلايا مع 15 ميكروليتر من 1٪ من الألبومين المصل البقري، أو BSA، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم غسالة اللوحة لاستنشاق مصل الحجب ، وإضافة 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام إلى الآبار المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، وغسل كل بئر مع 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتسمية الخلايا مع 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بالنسبة للتلوين النووي للخلايا، أضف 10 ميكرولترات من صبغة نووية مناسبة لكل بئر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني كما هو موضح.

تسمية الخلايا مع 10 ميكرولترات من قناع الخلية في بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تليها غسل الماضي مع برنامج تلفزيوني. ثم الاستغناء 60 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني جديد لكل بئر، وختم لوحات مع رقائق الألومنيوم حتى التصوير.

لتصوير الخلايا، التقط أربع صور في البئر على جهاز تصوير عالي المحتوى باستخدام القنوات الفلورية المناسبة تحت الهدف 10 مرات باستخدام التركيز التلقائي بالليزر وتطبيق binning على أثناء الاستحواذ. ثم تخزين الصور كملفات نقطة tiff رمادية 16 بت مع البيانات الوصفية. لا ينبغي أن تتعطل التعرف على الأجسام المضادة عن طريق التغيرات التشكلية في البروتين الهدف التي قد تكون مستحثة عن طريق ملزمة ليغاند.

على سبيل المثال، BIRB796 لديه معدل إيقاف طويل، وتحديد كمية المشاركة المستهدفة ممكن فقط عن طريق تطبيق خطوة استرداد مستضد. هذه التجربة التمثيلية منحنى التجميع الحراري للخلايا المعالجة بمركبات التحكم الإيجابية والسلبية توضح نطاقات تثبيت البروتين النموذجية بعد علاج الخلايا بالمركبات في درجات حرارة مختلفة. هنا نموذجي تجربة بصمة الجرعة الحرارية استجابة يظهر لإظهار نطاقات تمثيلية لتثبيت البروتين استجابة لجرعات مختلفة من مركب تجريبي.

تطبيق تحديات الحرارة الحرارية الأيزوحرارية للفحص المركب لتحديد المجلدات الجديدة للبروتين المستهدف يسمح بتحليل عدد كبير من المركبات بتركيز واحد في وقت واحد، قبل بصمة الجرعة الحرارية للإستجابة للإيدز لتأكيد استقرار البروتين المستهدف. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الظروف التجريبية الدقيقة، مثل طول ودرجة حرارة التحدي الحراري تؤثر على القوة الملحوظة للمركبات. لا تنس أن العمل مع شبه شكلي يمكن أن تكون خطرة للغاية.

وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل اتباع المبادئ التوجيهية للسلامة المؤسسية، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.