تقييم التفاعل بين بروتين C1Q وحمض الهيالورونيكس في تعزيز التصاق الخلايا
يونيو 15, 2019
مكون تكملة C1q هو جزيء الموالية للالتهابات أعرب بشدة في الأنسجة microenvironment التي يمكن أن تتفاعل مع مصفوفة خارج الخلية. هنا، ونحن نوصف طريقة لاختبار كيف C1Q ملزمة لحمض الهيالورونيكس يؤثر التصاق الخلية.
إجراء شامل لتقييم التفاعل بين بروتين مكمل C1q وحمض الهيالورونيك في تعزيز التصاق الخلية. لقد حددنا مؤخرا أن مكون مكمل C1q جزيء من الجهاز المناعي الفطري وأعرب عن ذلك بشدة في الورم والمشيمة microenvironment وقادرة على التفاعل مع عنصر من المصفوفة خارج الخلية. في هذه الحالة، حمض الهيالورونيكس.
نقترح طريقة لدراسة الوظائف البيولوجية للبروتينات في جميع أنحاء البيئة الأكرونية. من أجل التحقيق في قدرة هذه الجزيئات على تشكيل خصائص انقسام الخلية من عوامل مصفوفة خارج الخلية. من أجل دراسة كيف يمكن أن يكون هذا التفاعل يمكن أن يكون متحسسا من قبل الخلايا الموجودة في أنسجة البيئة، وضعنا هذه الطريقة السهلة التي سمح للخلايا الثنائية المستمدة من الأنسجة البشرية إلى التمسك C1q ملزمة مصفوفة خارج الخلية، في هذه الحالة حمض الهيالوروني.
لإجراء الطلاء الخطوة الأولى هي ربط حمض الهيالورونيكس الوزن الجزيئي العالي إلى 96 طلاء الأنسجة جيدا microplate. للطلاء، يتم تخفيف حمض الهيالوروك في 0.1 مول الكربون العازل PH 9.6 بتركيز 15 ميكروغرام لكل ملليلتر. ويتم requited الأنابيب بلطف لتحقيق حل متجانس.
وتستخدم 100 ميكروليتر من الحل لمعطف الآبار. ثم يتم نقل اللوحة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اليوم التالي فراغ التعرق الآبار المعالجة.
غسل مرة واحدة مع dPBS. يضاف إما C1q أو BSA في الآبار المقابلة. C1q هو في الوقت الحاضر متاحة تجاريا بتركيز واحد ملليغرام لكل ملليلتر، ويتم تخفيفه بتركيز 25 ميكروغرام لكل ملليلتر.
وdPBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.7 ملليمول الكالسيوم والمغنيسيوم والكاتيونات المغنية. يستخدم BSA LPS الحرة في تركيز 0.5٪ والتاريخ PBF. ثم يتم نقل لوحة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
يتم تحديد التفاعلات C1q تعتمد الجرعة مع حمض الهيالورونيم شل الحركة من قبل إنزيم مرتبط مناعي SA. الخلايا التي تحمل علامات مع DiI سريع. يتم استخدام ديي شفة سريعة لتسمية الخلايا من الفائدة. وتستخدم الخلايا التي يتم إعادة اعتمادها في dPBS بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر.
يتم تخفيف DiI سريع واحد إلى 100 مباشرة في تعليق الخلية. يتم خلط تعليق الخلية يدويًا ونقله عند درجة 37 مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد خمس دقائق حضانة، مزيج تعليق الخلية وتكرار هذه العملية مرتين أكثر.
لإزالة الزائدة من DiI سريع، إضافة 10 ملليلتر من dPBS. محوري بلطف صعودا وهبوطا والطرد المركزي في 250 غرام لمدة سبع دقائق. Resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من مصل endophilical الإنسان المتوسطة الحرة في وجود 0.1 ٪BSA.
الخلايا التصاق على المصفوفات حمض الهيالوروني C1q. فراغ التعرق DPBS من الآبار المغلفة. توزيع 100 ميكرولترات من تعليق الخلية المسمى على الآبار المغلفة.
يتم أخذ 200 ميكرولترات من الخلايا المسماة بعيدا في أنبوب ependure لاستخدامها في توليد منحنى القياسية. احتضان لوحة لمدة 35 دقيقة في 37 درجة مئوية. أخرجي الصحن من الحاضنة
pirate بلطف الخلايا غير متوازن. غسل مرة واحدة مع dPBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.7 ملليمول الكالسيوم والمغنيسيوم. ليس الخلايا المتمسكة بإضافة 200 ميكرولترات من العازلة تحلل.
في الوقت نفسه إعداد منحنى القياسية على تخفيف واحد إلى اثنين المسلسل من الخلايا المسمى في العازلة تحلل. قم بقراءة إشارة الفلوريس في جهاز F 200 T-can اللانهائي باستخدام 544 نانومتر كطول موجي مثير و590 نانومتر كطول موجة للانبعاثات. نتائج تمثيلية.
كما هو مبين في النتائج التمثيلية، فمن الواضح أن التصاق الخلية على حمض الهيالوروني وجدت C1q كما عززت بقوة بالمقارنة مع HA وحدها أو HA ملزمة BSA. يتم حساب النسبة المئوية للخلايا المنضمة على كل مصفوفة على أساس المنحنى القياسي. الاستنتاجات. في تجاربنا أولا وقبل كل تقييمنا قدرة المكون المكمل C12 لربط مصفوفة خارج الخلية في هذه الحالة حمض الهيالورونيكس باستخدام معدن أريسال.
ثانياً قمنا بتحليل قدرة الخلايا الأولية البشرية الملطخة بصبغة الفلورسنت لمتابعة حمض الهيالورونيكس المقيد. النموذج الذي اقترحناه في هذه الدراسة هو طريقة أسهل وأسرع وأرخص في بديل لنموذج 3D من السقالات مصفوفة خارج الخلية لتقييم على هذه الاستجابة الخلوية لمزيج من المحفزات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستكشف هذه الدراسة التفاعل بين مكون المتممة C1q وحمض الهيالورونيك، مع التركيز على كيفية تأثير هذا التفاعل على التصاق الخلايا. ويُعبر عن C1q، وهو جزيء محفز للالتهابات، بشكل كبير في البيئات الدقيقة للأورام والمشيمة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علوم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم المناعة
خلفية علمية
- يعد C1q جزءاً من الجهاز المناعي الفطري.
- يتم التعبير عنه بشكل كبير في بيئات دقيقة نسيجية محددة.
- يتفاعل C1q مع مكونات المصفوفة خارج الخلوية.
- يعد حمض الهيالورونيك مكوناً رئيسياً للمصفوفة خارج الخلوية.
الغرض من الدراسة
- تقييم دور C1q في التصاق الخلايا.
- بحث كيفية تأثير C1q المرتبط بحمض الهيالورونيك على سلوك الخلايا.
- تطوير طريقة لدراسة التفاعلات البروتينية في البيئة خارج الخلوية.
الطرق المستخدمة
- تم استخدام خلايا ثنائية مشتقة من أنسجة بشرية.
- سُمح للخلايا بالالتصاق بـ C1q المرتبط بحمض الهيالورونيك.
- وُضعت إجراءات شاملة لغرض التقييم.
- تم تقييم الوظائف البيولوجية للبروتينات في سياق المصفوفة خارج الخلوية.
النتائج الرئيسية
- يعزز التفاعل بين C1q وحمض الهيالورونيك من التصاق الخلايا.
- تستجيب الخلايا لوجود C1q في المصفوفة خارج الخلوية.
- توفر هذه الطريقة رؤى حول خصائص انقسام الخلايا المتأثرة بالعوامل خارج الخلوية.
- قد يكون لهذه النتائج دلالات في فهم الاستجابات المناعية في بيئات الأنسجة.
الاستنتاجات
- يلعب C1q دوراً هاماً في التصاق الخلايا من خلال تفاعله مع حمض الهيالورونيك.
- يمكن تطبيق الطريقة المطورة لمزيد من الدراسة حول تفاعلات البروتين.
- قد يؤدي فهم هذه التفاعلات إلى تعزيز المعرفة بوظائف الجهاز المناعي في الأنسجة المختلفة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر فهم كيفية قيام بروتين المتممة C1q بتعديل مكونات المصفوفة خارج الخلوية، مثل حمض الهيالورونيك، رؤية ميكانيكية للتفاعلات بين الورم والسدى التي تدفع التقدم المرضي بوساطة الالتصاق. يتيح هذا الفحص التقييم المبكر للمخاطر المتعلقة بالأهداف المشاركة في إعادة تشكيل البيئة المجهرية من خلال قياس كيفية تأثير الإشارات المشتقة من الجهاز المناعي على سلوك الخلايا المعتمد على المصفوفة. وتدعم هذه الطريقة التحقق من صحة الأهداف في مجال المناعة الورمية عبر ربط المؤثرات المناعية الفطرية بالتغيرات الوظيفية في المصفوفة خارج الخلوية ذات الصلة بالقدرة النقلية للورم.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يبحث في كيفية تأثير ارتباط C1q بحمض الهيالورونيك على خصائص المصفوفة للتأثير على التصاق الخلايا الورمية، مما يدعم التحقق الوظيفي من أهداف الوسائط البيئية الدقيقة.
- القيمة التشغيلية: يتيح اختبار فرضية إعادة تشكيل المصفوفة المدفوعة بالمتممة في تنسيق منضبط وقابل للتكرار باستخدام خلايا بشرية أولية مشتقة من أورام.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يولد قراءات كمية تعتمد على الفلورة لالتصاق الخلايا بمصفوفات C1q-HA، مما يتيح تحليل الاستجابة للجرعة لتفاعلات البروتين والمصفوفة.
- القيمة التشغيلية: يستخدم بروتوكول طلاء قياسي لـ 96 بئرًا بتركيزات محددة من HA (15 µg/mL) و C1q (25 µg/mL) لضمان تكرار المقايسة عبر حملات الفحص.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: ينمذج كيف يقوم بروتين C1q الذي يعبر عنه الورم بإعادة تشكيل الالتصاق بوساطة HA، مما يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لدراسة تنشيط السدى في الأورام.
- القيمة التشغيلية: يجسّر الفجوة بين الاكتشاف والعمل قبل السريري من خلال توفير طريقة قابلة للتوسع لتقييم التدخلات التي تستهدف المادة الخلالية باستخدام مدخلات خلوية بشرية ذات صلة سريرياً.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف الممتدة من ارتباط الهدف إلى الفرز المظهري، حيث يعمل الالتصاق المعتمد على المصفوفة كقراءة وظيفية لتعديل المسارات في البيئة الدقيقة للورم.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال اختبار ما إذا كان التفاعل بين C1q-HA يحفز الأنماط الظاهرية المحفزة للالتصاق في الخلايا الورمية البشرية الأولية.
- الفحص: يوفر مخرجات التصاق كمية وموحدة متوافقة مع التقييم متوسط الإنتاجية لمعدلات ربط البروتين بالمصفوفة.
- التحليلات: يتيح قياس كمية إشارة الفلوريسنت عبر المنحنى القياسي إجراء مقارنة دقيقة لظروف الالتصاق عبر مصفوفات HA وC1q-HA وBSA-HA.
- الأبحاث الانتقالية: تستخدم خلايا مشتقة من أورام بشرية ومكونات مصفوفة ذات صلة فسيولوجياً لتعزيز الثقة الانتقالية في استراتيجيات استهداف البيئة الدقيقة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمكن تكييف المنصة لدراسة بروتينات أخرى في المصفوفة خارج الخلية ووسطاء مناعيين بخلاف C1q وHA، مما يدعم التوحيد القياسي عبر المشاريع.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في التواصل بين الورم والسدى من خلال عزل تأثير C1q على الالتصاق المعتمد على HA.
- القيمة التشغيلية: تعزز خطوات الطلاء والحجب المحددة (مثل الحضن طوال الليل عند 4°C، والغسل باستخدام dPBS) من توحيد المقايسة وقابلية تكرارها بين المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال قياس كيفية تأثير تفاعلات المصفوفة المناعية على السلوكيات الورمية المبكرة مثل النمو المعتمد على الالتصاق.
- تأثير المحفظة: يتيح ترتيب أولويات الأهداف المشاركة في التداخل بين المتممة والمصفوفة بناءً على نتائج الالتصاق الوظيفي مع مراعاة المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في طلاء البروتينات، وزراعة الخلايا، وتقنيات القياس الكمي القائمة على الفلورة.
- يعتمد على توفر أجهزة قراءة الأطباق الدقيقة الفلورية القادرة على الإثارة عند 544 nm والانبعاث عند 590 nm للكشف السريع عن DiI.
- يستلزم توحيد بروتوكولات وسم الخلايا (مثل تخفيف fast DiI، وأوقات الحضن) لضمان اتساق الإشارة عبر التجارب.
- قد يتطلب التكيف مع بروتينات مصفوفية أخرى تحسين محاليل الطلاء وظروف الحضن للحفاظ على الوظيفة البروتينية.
- تشمل المحددات الاعتماد على نماذج الالتصاق ثنائية الأبعاد (2D)، والتي قد لا تعكس بشكل كامل تعقيد السدى ثلاثي الأبعاد (3D) الملاحظ في الجسم الحي.
