الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران

يمكن أن تدخل النواقل الفيروسية مواد وراثية إلى الخلايا للتعويض عن الجينات المعيبة، أو لتنظيم بروتينات النمو الهامة، أو لتصنيع علامات يمكن أن تتبع الدوائر العصبية. إدخال ناقلات الفيروسية في الجهاز العصبي هو التحدي بسبب الحواجز البيولوجية الفطرية. الحقن المباشر في أنسجة الحبل الشوكي يتجاوز هذه الحواجز، مما يسمح بالوصول إلى أجسام الخلايا أو نقاط الاشتباك العصبي.

استهداف مستويات العمود الفقري L1 إلى L4 بشكل صحيح قد يكون صعباً. من المهم استخدام المعالم للتحقق من الهدف وتذكر أن هذه الأجزاء خط إلى T11 إلى T13 الفقرات. في يوم الإجراء، قم بتوصيل المحاقن بالمضخة الدقيقة ووضع المضخة الصغيرة في ميكرو مانايبولاتور مع مقياس فيرنييه.

استخدام حقنة مع إبرة مرنة لتحميل بعناية صبغة ملونة في واحدة من الإبر الزجاجية وإدراج إبرة الزجاج في حاقن. ثم تأكد من أن الإبرة هي المصنفة بشكل صحيح في غسالات، وأن هو مشدود غطاء حاقن على ضيق، ويتم تمديد الإبرة حاقن الصلب ما يقرب من ثلاثة أرباع طول إبرة الزجاج. قبل البدء في الإجراء ، ذوبان ما لا يقل عن ميكرولتر واحد ، بالإضافة إلى حجم صغير من الفيروس الإضافي لكل حقنة من تخزين الفريزر ، وتأكيد عدم استجابة قرصة إصبع في فأر مُجرّد.

حلق على طول خط الوسط الظهري من الوركين إلى الزاوية السفلية للكمية من الحيوان، وسحب مشدود الجلد لحلاقة أسهل وأكثر دقة، وتطهير الجلد المكشوف مع 5٪ من اليود متتابعة و 70٪ الإيثانول الدعك. تطبيق مرهم العيون على كلتا العينين. ثم ضع الحيوان على قطعة قماش معقمة ووضع الشاش تحت المثانة لجمع أي البول.

لتحديد موقع شق الجلد، اضغط على الأصابع بلطف في الضلع الأخير لتحديد موقع الفقرات L1. باستخدام هذه الفقرات كمعلم وعقد الجلد مشدود من قبل انتشار لطيف في حين الضغط بحزم مع مشرط، واستخدام شفرة جراحية رقم 10 لجعل شق من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من الجلد تنتهي أدنى فقط إلى L1 لفضح العضلات. استخدام ملقط ومقص ليشعر للعمليات spinous.

جعل تخفيضات صغيرة من التخفيضات الرسترالية للسماح فسحة للاستيلاء بشكل آمن على عملية العلوي مع ملقط الأسنان الفئران. وجعل اثنين من التخفيضات طويلة وعميقة أقرب إلى العمليات ممكن. بعد تأمين العضلات الجانبي في مكانها، واضحة العضلات حول العمليات لتحديد شكل رؤوسهم.

ثم تصور أشكال رؤساء العمليات العرضية من أجل تحديد موقع استئصال لاميني. T11 والانضمام T12 و T13 العمليات ستكون موقع استئصال لامينك. بمجرد تحديد المنطقة المستهدفة بشكل صحيح ، انتشر الفقرات بلطف للكشف عن الأربطة الفقرية ، واستخدام الرانكورات لأخذ لدغات صغيرة من العمليات العرضية والجانب الظهري من الفقرات.

اخلي العظم بعيدا عن خط الوسط بحيث يمكن ملاحظة الأوعية الدموية المتوسطة، تاركة نافذة تكشف بوضوح عن أنسجة الحبل الشوكي وخالية من الحطام. ثم ربط ملقط تثبيت للعمليات العرضية الرسترالية وcaudal إلى نافذة استئصال لامينك لتأمين الحيوان في حامل العمود الفقري. ورفع بطن الحيوان لنفي تأثير حركات التنفس.

لتحميل الفيروس في حاقن، ما يقرب من خمسة ميكرولترات من المخزون المذاب على قطعة من بارا فيلم، ووضع الإبر الزجاجية بحيث تلميح هو داخل قطرة. استخدام مضخة صغيرة لسحب ما يصل إلى أربعة ميكروليترس من الفيروس بمعدل 20 إلى 100 نانولتر في الثانية الواحدة، وتعيين وحدة تحكم لحقن قبل الإفراج عن كمية صغيرة من الفيروس من طرف إبرة لضمان عدم حظره. مسح أي فيروس الزائدة مع مسح المختبر ووضع micromanipulators بحيث مقياس vernier مرئية.

ضع الإبرة في خط الوسط في الحبل الشوكي، واستخدم مقياس vernier على المايكروmanipulator لتوجيه الإبرة بشكلٍ جزئي 0.8 ملليمتر. ثم خفض الإبرة إلى وتر العمود الفقري حتى يتم المسافات البادئة، ولكن ليس ثقب، dura، واستخدام حركة التواء سريعة لثقب دورا مع الإبرة حتى غرقت طرف إبرة إلى عمق 1.5 ملليمتر. وبمجرد أن تكون الإبرة في مكانها، قم ببرمجة المحاقن لتوصيل الفيروس بمعدل 400 نانولتر في الدقيقة، وتأكد من دخول الفيروس إلى وتر العمود الفقري من خلال مراقبة تقدم جبهة الصبغة.

بمجرد الانتهاء من الحقن ، اسمح للإبرة بالراحة في الحبل الشوكي لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق لتسهيل انتشار الفيروس ، قبل سحب الإبرة ببطء لتحديد المواقع في موقع الحقن التالي. بعد الحقن الأخير، قم بإزالة الحيوان من حامل العمود الفقري للسماح بإزالة أي أجهزة تستخدم لنشر العضلات الجانبي. ثم أغلق العضلات بخياطة 1.4 كروميك وتدبّر الجلد بمقطّط جرح من عيار 9 ملليمترات.

بعد أربعة أسابيع من الحقن الناجح ، لوحظ تعبير GFP كبير في الخلايا العصبية داخل المادة الرمادية من الحبل الشوكي الصدري على الجانب ، وipsilateral للحقن. في المادة البيضاء ، ويلاحظ تعبير GFP في محاور في الحبل الإبسي، وخاصة في المناطق النموذجية لمحور عصبي propriospinal. التكبير أعلى من الخلايا العصبية المادة الرمادية يكشف عن مثال على تعبير إشارة نموذجية في أجسام الخلايا العصبية وdendrites.

ويمكن أيضا أن يلاحظ تعبير GFP في الخلايا العصبية في النوى جذع الدماغ، مثل داخل تكوين النتينة. العوامل الرئيسية لنجاح عملية حقن الحبل الشوكي هي استهداف العمود الفقري الصحيح وضمان أن الفيروس يدخل الأنسجة إذا تم إجراء إصابة الحبل الشوكي الرسترالي قبل هذا الإجراء، يمكن استخدام الحقن المباشر لتتبع الخلايا العصبية التي تعيد إنشاء اتصالات حول الإصابة.