الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

يفتقر مجال بحوث شيغيلا حالياً إلى مقايسات محددة جيداً لدراسة الدور الوظيفي للأجسام المضادة التي يولدها التحصين أو العدوى. يمثل هذا الفحص طريقة محددة بشكل جيد لتأهيل هذه الاستجابات المناعية وقياس النشاط المبيد للجراثيم من الأجسام المضادة المحددة Shigella. والميزة الرئيسية لهذا الفحص هو أنه يسمح لتحليل الإنتاجية العالية من عينات متعددة.

التقنيات المستخدمة في هذا البروتوكول تقلل إلى حد كبير التدريب العملي على الوقت وعموما الوقت لقياس القتل البكتيري المباشر من الأجسام المضادة وعينات المصل. للبدء، احتضان العينات في حمام الماء الدافئ في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسخين وتنشيط عينات الاختبار. الحصول على لوحة المقايسة و 20 ميكرولترات من المخزن المؤقت للماساي إلى أعمدة واحد من خلال اثني عشر من الصفوف ألف من خلال G.Add 20 microliters من المخزن المؤقت للماحصة إلى أعمدة واحد واثنين من الصف H.Load 30 ميكرولترات من كل عينة اختبار وتكرارها إلى الصف H من لوحة المقايسة.

للبدء في تنفيذ عمليات تخفيف تسلسلية ثلاثية العينات من اختبار، استخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة 10 ميكرولترات من الآبار 3H من خلال 12H. نقل العينات إلى الآبار المقابلة في الصف G والماصات صعودا وهبوطا 8 إلى 10 مرات لخلط العينة جيدا. ثم، إزالة 10 ميكرولترers من هذه الآبار.

نقل إلى الآبار المقابلة في الصف F والماصات صعودا وهبوطا 8 إلى 10 مرات لخلط. مواصلة هذه العملية التخفيف المسلسل من خلال الصف A.After خلط الآبار في الصف A، وإزالة وتجاهل 10 ميكرولترات من الآبار 3A من خلال 12A بحيث يكون حجم النهائي في جميع الآبار هو 20 ميكرولترات. استرداد قارورة واحدة من المخزون البكتيري الهدف المجمدة وذوبان في درجة حرارة الغرفة.

ثم، تمييع البكتيريا في 20 ملليلتر من العازلة المقايسة. وفقا ل العامل المخفف الأمثل المحدد سلفا. باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 10 ميكرولترات من البكتيريا المخففة إلى كل بئر من لوحة المقايسة.

استرداد قارورة واحدة من الطفل الأرنب المجمدة مجاملة وقارورة واحدة من الحرارة المجمدة تنشيط BRC. استخدام المياه الجارية الباردة لإذابة قنينات إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، مزيج 100 ميكرولترات من الحرارة تنشيط BRC مع 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت المقايسة.

إضافة 50 ميكرولترات من هذا 20 في المئة الحرارة تنشيط BRC حل لجميع الآبار في العمود الأول. مزيج ملليلتر واحد من BRC الأصلي مع أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للمقايسة. إضافة 50 ميكرولترات من هذا الخليط 20 في المئة إلى جميع الآبار في الأعمدة من اثنين إلى اثني عشر.

وضع لوحة واحدة من لوحة شاكر لمدة 10 إلى 15 ثانية لخلط بلطف لوحة المقايسة. احتضان لوحة المقايسة في حاضنة الميكروبيولوجية لمدة ساعتين. وفي الوقت نفسه، إزالة الأغطية من اثنين من لوحات LB أغار ووضع لوحات الوجه في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 40 إلى 60 دقيقة لتجف.

عندما تكتمل الحضانة، قم بنقل صفيحة المقايسة إلى الثلج الرطب واحتضان لمدة 10 إلى 20 دقيقة لوقف التفاعل. باستخدام ماصة قناة اثني عشر، مزيج الآبار في الصف H ولوحة بقعة 10 ميكرولترات من خليط التفاعل على الجزء السفلي من لوحة LBA. إمالة على الفور لوحة والسماح للبقع لتشغيل لحوالي 1.5 إلى 2 سم.

كرر هذا الإجراء للصفوف G و F و E، واكتشافها فوق الصف السابق. احتضان لوحات LBA في درجة حرارة الغرفة حتى يتم امتصاص الحل في لوحات LBA. ثم، وضع الأغطية على لوحات ونقلها رأسا على عقب إلى حاضنة الميكروبيولوجية لاحتضان بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي، إضافة 25 ملليلتر من تراكب أغار في 55 درجة مئوية، تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر TTC و 0.1 في المئة أزيد الصوديوم إلى كل لوحة LBA. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للسماح للبكتيريا على قيد الحياة لتطوير لون أحمر. ثم استخدم كاميرا رقمية لتصوير اللوحات.

نقل الصور إلى جهاز كمبيوتر واستخدام برنامج تعداد المستعمرة المتكاملة من NIST لتحليل الصور كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر لوحات LBA التمثيلية أن تطور اللون قد حدث بعد الحضانة الليلية وإضافة التراكب ، مع رؤية جميع المستعمرات الباقية باللون الأحمر. وينظر بوضوح القتل البكتيري لجميع العينات التي تم اختبارها في أول ثلاثة dilutions.

وينظر إلى انخفاض في القتل البكتيري كما يتم تخفيف العينات مزيد من أعلى لوحة والمصل هو أقل تركيزا. ثم يتم تنفيذ عمليات حساب الكولكون الدقيقة باستخدام برنامج NIST. ثم يتم حساب متوسط عدد CFU لكل تخفيف لكل عينة، كما هو قيمة القتل 50 في المئة.

ثم يتم تطبيق هذه القيمة القاتلة بنسبة 50 في المائة على متوسط وحدات CFUs لكل تخفيف للمصل لتحديد القيم اللازمة لحساب SBA KI. يعتمد هذا البروتوكول على طلاء بكتيري متناسق وموحد على LB Auger. وسوف تسمح جيدة طلاء بقعة وتقنية إمالة لنمو ميكروكولوس منفصلة ودقيقة عد مستعمرة. هذه التقنية يستخدم الشيغيلا حية وهدّي ويتطلب تقنية ااولة السليمة وPPE لضمان البكتيريا يتم التعامل معها بأمان وفقا لإجراءات BSL 2.