تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر
أغسطس 23, 2019
يوصف هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر.
يمكن استخدام بروتوكولنا على نطاق واسع في الفرز السريع والتفاعلات بين الإنيدوبيوتيك وميكروبات الأمعاء البشرية. منخفضة التكلفة وتجنب آثار التدخل من التمثيل الغذائي للمضيف. هذا الإجراء لديه القدرة على استخدامها في التشخيص.
أولاً، حل BIF EPS والنشا بشكل فردي في الماء الساخن على محرض مغناطيسي لجعل كل من تركيز ثمانية غرامات لكل لتر. في المتوسط الثقافة الأساسية المعدة، سادسا، إضافة 100 ملليلتر من حل BIF EPS لجعل الثقافة VI BIF الحل. إضافة 100 ملليلتر من محلول النشا لجعل الثقافة السادسة حل النشا.
اضبط الوسائط مع مصدر الكربون، ووسيط دون مصدر الكربون كتحكم، في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. السماح لهم لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة هايمين والسيستيين. نقل عينة فرعية من خمسة ملليلترات من كل المتوسطة إلى أنابيب الثقافة.
وتخزينها في حاضنة لاهوائية. تخزين وسائل الإعلام المتبقية في أربع درجات مئوية. لإعداد عينة البراز البشري، نقل غرام واحد من عينة البراز الطازجة إلى 10 ملليلتر من 0.1 PBS اللاهوائية الضرس في رقم 7 في كوب زجاجي.
ثم استخدم قضيب زجاجي لتحريكه لتحقيق الطين. في غرفة اللاهوائية، إضافة 500 ميكرولترات من الطين البراز المصفاة في وسائل الإعلام التخمير الثلاثة المعدة، بشكل فردي. ثم، احتضان في 37 درجة مئوية.
بعد 24 ساعة و 48 ساعة ، جمع ميليلترين من العينات المخمرة في الغرفة اللاهوائية. وبعد ذلك الطرد المركزي خارج الغرفة في 6000 مرة G، لمدة ثلاث دقائق. نقل بعناية المواد العملاقة إلى أنابيب جديدة للطرد المركزي التي سيتم استخدامها لتحليل تدهور السكريات المتعددة وقياسات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة.
تخزين الكريات الطرد المركزي في 80 درجة مئوية. تحميل 0.2 ميكرولترات من المخمرة عظمى على كل هلام السيليكا المغلفة مسبقا 60 TLC لوحة الألومنيوم ودوامة لانتشار. ثم استخدام مجفف الشعر مع الهواء الساخن لتجف.
تزج واحدة من نهاية لوحات العينات في 20 ملليلتر من حمض الفورميك: ن-بوتانول:محلول المياه لعدة دقائق، حتى الكهرباء يمتد تقريبا إلى الطرف الآخر. ثم أخرج الألواح بالملاط، وجففها بمجفف شعر. ثم نقع لوحات في كاشف orcinol لمدة دقيقتين لصبغ.
وتجف مرة أخرى. نقل لوحات إلى فرن الخبز في 120 درجة مئوية لتسخين لمدة ثلاث دقائق. ثم التقاط صور من لوحة لتقييم تدهور EPS عن طريق قياس نطاقات TLC.
لدراسة آثار EPS على إنتاج SCFA، إضافة ملليلتر واحد من المخمرة لأجهزة الطرد المركزي أنابيب ملليلتر 2 ملليلتر وإضافة 0.2 ملليلتر من 25 الوزن / حجم في المئة من حمض ميتافوسفوريك لكل عينة. دوامة لخلط شامل الحلول. الطرد المركزي الخلائط في 13،000 مرات G لمدة 20 دقيقة.
في غضون ذلك، وإعداد حلول من 120 ملليمولار الخليك، بروبيونيك، بوتيريك، الأيزوبوتريك، فالريك، والأحماض الايسفالية في الأنابيب. ثم إضافة ملليلتر واحد من كل حمض المعدة إلى أنبوب يحتوي على 1.2 ملليلتر من 25 وزن / حجم في المئة حمض ميتافوسفوريك. وتحميلها في زجاجة عينة من صك الغاز الكروماتوغرافيا والكوكتيلات القياسية.
أخرج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي، ونقل المنابتات إلى أنابيب جديدة. استخدم حقنة مجهزة بفلاتر 0.22 ميكرون لتصفية المواد الخارقة إلى أنابيب جديدة لتحليل الكروماتوغرافيا الغازية. في هذه الدراسة، لوحظ إنتاج EPS mucoid في الثقافات bifidobacterium longum على لوحات PYG، بعد حضانة لاهوائية لمدة 72 ساعة.
أدى الطرد المركزي لخدوش الثقافة، تليها ترسيب الإيثانول والتجفيف، إلى جمع EPS مثل السليلوز. وكشف تحليل TLC أن معدل تحلل النشا من قبل الميكروبات البرازية البشرية كان أسرع من ذلك في BIF EPS. يظهر التحليل التنسيقي الرئيسي الثقافة VI BIF، والثقافة VI مجموعات النشا، تتجمع بشكل منفصل عن بعضها البعض، مشيرا إلى أن EPS والنشا توافر تشكيل تفاضلي المجتمعات البكتيرية البراز الإنسان.
تحليل Discriminant الخطي على حجم تأثير يظهر جينيرا كولينسيلا، coprococcus، parabacteroides، و rhodopseudomonas كانت أكثر وفرة بشكل ملحوظ في عينات BIF السادس الثقافة مما كانت عليه في عينات النشا الثقافة VI. وعلاوة على ذلك، فإن قياسات GC تظهر SCFAs التي تم قياسها من ثقافات التخمير شملت الخل، البرروبيونيك، الأيزوبوتريك، البوتريك، البويضة، والأحماض الفريكة. وبعد التخمير لمدة 24 ساعة و48 ساعة، كانت خمسة من تركيزات SCFA الستة متشابهة ولا تختلف إحصائياً بين ثقافة VI BIF، والنشا في الثقافة VI، ومجموعات الثقافة السادسة.
ومع ذلك، كانت تركيزات حمض proprionic أعلى بكثير في مجموعة VI BIF الثقافة مما كانت عليه في مجموعة النشا في الثقافة VI، بعد 48 ساعة من التخمير. قم بهذه التجربة في ظل ظروف لاهوائية، ثم قم بنقل العينات الثابتة إلى حاضنة لاهوائية في أقرب وقت ممكن. بعض الكواشف TLC خطرة.
يجب أن تكون حذراً لاستخدامها.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يستقصي هذا البروتوكول التفاعلات بين المواد الحيوية الداخلية (endobiotics) وميكروبات الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير دفعية في المختبر. وقد صُمم هذا النظام لإجراء مسح سريع وعالي الإنتاجية، مع تقليل التداخل الناتج عن عملية التمثيل الغذائي للعائل.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- صحة الأمعاء
- علم الأيض
خلفية علمية
- تلعب الكائنات الحيوية الداخلية دوراً حاسماً في صحة الإنسان.
- تؤثر ميكروبيوم الأمعاء بشكل كبير على العمليات الأيضية.
- يمكن أن يساعد فهم هذه التفاعلات في عمليات التشخيص.
- قد تكون الطرق الحالية محدودة بسبب تداخل عملية التمثيل الغذائي للعائل.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لدراسة التفاعلات بين الكائنات الداخلية والميكروبات المعوية.
- تمكين الفحص عالي الإنتاجية لهذه التفاعلات.
- توفير بديل منخفض التكلفة للأبحاث.
الطرق المستخدمة
- إذابة BIF EPS والنشا في الماء الساخن.
- تحضير الأوساط الزرعية للتخمير.
- استخدام أنظمة التخمير الدفعي لدراسات التفاعل.
- مراقبة تأثيرات المواد الحيوية الداخلية (endobiotics) على ميكروبات الأمعاء.
النتائج الرئيسية
- التحضير الناجح لمحاليل BIF EPS والنشا.
- وضع بروتوكول تخمير موثوق.
- إثبات إمكانات البروتوكول في التشخيص.
- فهم التفاعلات بين المواد الحيوية الداخلية (endobiotics) والميكروبيوتا.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة لأبحاث الميكروبيوتا.
- ويمكن أن يسهل فهم التفاعلات الأيضية.
- قد تعمل التطبيقات المستقبلية على تعزيز القدرات التشخيصية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول إجراء مسح عالي الإنتاجية ومنخفض التكلفة في المختبر (in vitro) للتفاعلات بين المواد الداخلية الحيوية (endobiotics) وميكروبيوتا الأمعاء، مما يقلل الاعتماد على النماذج الحيوانية ويقلل من تداخل عملية التمثيل الغذائي للعائل. كما يدعم هذا البروتوكول التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من خلال توفير بيانات كمية حول التحولات في المجتمع الميكروبي وإنتاج المستقلبات، وهي أمور بالغة الأهمية لتقليل المخاطر المرتبطة بالعلاجات التي تعدل الميكروبيوما. ويُطبق هذا النهج بشكل مباشر في سير عمليات الاكتشاف قبل السريرية، حيث يساهم الفهم الميكانيكي لتأثيرات المركبات على الميكروبيوتا في توجيه عملية اختيار المركبات الرائدة واتخاذ قرارات المحفظة الدوائية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء كيفية قيام المواد الحيوية الداخلية، مثل البريبايوتكس أو الأدوية، بتعديل المجتمعات البكتيرية في أمعاء الإنسان، مما يدعم اختبار الفرضيات المستهدفة.
- القيمة التشغيلية: يستخدم طرقاً ميسرة مثل تسلسل 16S rRNA وتقدير كمية الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFA) لتوليد بيانات قابلة للتكرار ومعلوماتية من الناحية الميكانيكية.
- القيمة التنبؤية: يميز بين الاستجابات الميكروبية للكربوهيدرات المتميزة هيكلياً (على سبيل المثال، EPS مقابل النشا)، مما يساعد في تقييمات العلاقة بين البنية والنشاط.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفر ظروف تخمر لاهوائية موحدة لتقييم متسق لتحلل المركبات بتوسط الميكروبات المعوية.
- القيمة التشغيلية: متوافقة مع تنسيقات الإنتاجية العالية نظراً لبساطة تحضير العينات وإمكانية توسيع نطاق القراءات مثل TLC وGC.
- جاهزية المقايسة: تولد مخرجات قابلة للقياس الكمي (ملفات SCFA، وتحولات المجتمع الميكروبي) والتي يمكن استخدامها لمقارنة تأثيرات المركبات عبر حملات الفحص.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: يستخدم لقاحاً برازياً بشرياً، مما يعزز الصلة بالفسيولوجيا البشرية مقارنة بالنماذج الحيوانية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يحدد المستجيبات الميكروبية المحددة (مثل Collinsella وCoprococcus) للمواد الحيوية الداخلية (endobiotics)، مما يدعم آلية العمل المرتبطة بالمؤشرات الحيوية.
- الاستمرارية قبل السريرية: يتيح التوصيف المعتمد على الجرعة والوقت (24h/48h) لتحديد نوافذ السلامة والفعالية في النماذج اللاحقة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين المركبات الرائدة، لا سيما بالنسبة للمركبات ذات النشاط الميكروبيومي، حيث يعد فهم الاستقلاب الذي تتوسطه الميكروبيوتا أمراً أساسياً للتنبؤ بالسلوك داخل الجسم الحي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم الفرز الموجه بالفرضيات للمواد الحيوية الداخلية من خلال ربط التعرض للمركب بالتغيرات القابلة للقياس في التركيب والوظيفة الميكروبية.
- الفرز: يتيح التقييم السريع لتفاعلات الميكروبيوتا باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) لتحلل السكريات المتعددة، وكروماتوغرافيا الغاز (GC) لتقدير كمية الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFA) كمؤشرات قراءة متعامدة.
- التحليلات: يولد بيانات متعددة المتغيرات (تسلسل 16S، وتركيزات SCFA) تسمح بالمقارنة الإحصائية لآثار العلاج وتحديد التحولات الجوهرية.
- البحث الانتقالي: يستخدم ميكروبيوتا مشتقة من البشر، مما يحسن الثقة التنبؤية للترجمة السريرية مقارنة بنماذج الفئران.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: البروتوكول قابل للتكيف مع مختلف المواد الحيوية الداخلية (الأدوية، والبريبايوتكس، والسكريات المتعددة)، مما يجعلها منصة قابلة لإعادة الاستخدام عبر المجالات العلاجية المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في التفاعلات بين الميكروبيوتا والمواد الداخلية من خلال المراقبة المباشرة لأنماط التحلل والميكروبات المستجيبة.
- القيمة التشغيلية: تساهم التكلفة المنخفضة، وسير العمل اللاهوائي، وأخذ العينات الموحد في تحسين إمكانية التكرار والمقارنة بين المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح اتخاذ قرارات مبكرة بشأن الاستمرار أو التوقف من خلال تحديد عمليات التمثيل الغذائي التي تتوسطها الميكروبيوتا والتي قد تغير من فعالية الدواء أو سميته.
- التأثير على المحفظة: يدعم ترتيب أولويات المركبات بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً لتأثيرها على الميكروبيوتا المفيدة وملفات SCFA.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في علم الأحياء الدقيقة اللاهوائية والتقنيات التعقيمية للحفاظ على سلامة العينات.
- يتطلب الوصول إلى ألواح كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)، وكروماتوغرافيا الغاز، وبنية تحتية لتسلسل 16S rRNA من أجل لوحة القراءة الكاملة.
- يتطلب التوحيد القياسي عبر المختبرات معالجة متسقة للمتبرعين بالبراز وظروف تحضين لاهوائية ثابتة.
- يستلزم التكيف مع مواد حيوية داخلية أخرى إجراء اختبارات الذوبان والاستقرار تحت ظروف التخمير.
- تشمل القيود العملية التباين في ميكروبيوتا المتبرعين والحاجة إلى التعامل الحذر مع كواشف TLC الخطرة (على سبيل المثال orcinol و formic acid).
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
