نموذج زرع الشريان الاورطي لعنق الرحم من murine باستخدام تقنيه الكفة المعدلة غير الخياطة
نوفمبر 2, 2019
هنا ، نقدم بروتوكولا لزرع الابهر غير المتجانس في الفئران باستخدام تقنيه الكفة غير الخياطة في نموذج murine عنق الرحم. ويمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الامراض الاساسيه لاعتلال الاوعيه الدموية المزمنة الطعوم (CAV) ويمكن ان تساعد في تقييم العوامل العلاجية الجديدة من أجل منع تشكيلها.
أنا مارتن رايل من مختبرات البحوث في قسم عام وجراحة زرع الحشوية في LMU في ميونيخ. اليوم نحن نذهب لتظهر لك نموذج زرع الأبهر المورين غيريروتوبيك باستخدام تقنية معدلة غير خياطة الكفة. أولاً، تخدير الحيوان المتلقي بالحقن داخل الصفاق من ميدازولام، ميدتوميدين والفنتانيل.
قص جميع الشعر من منطقة عنق الرحم الجانبي مع مقص الشعر الكهربائي للحيوانات الصغيرة وتطبيق مرهم العيون مع مسحات القطن لمنع العينين من الجفاف أثناء العملية. وضع الحيوان في موقف supine على وسادة التدفئة تحت المجهر وشريط بلطف ساقيه إلى طاولة التشغيل مع شرائط الجص الحساسة للجلد. إمالة رأسه إلى الوراء وفرك حقل المنطوق عدة مرات مع الكحول.
جعل شق الجلد من شق الوداجي إلى الفك السفلي الأيمن مع مقص صغير. إزالة الفص السفلي الأيمن من الغدة تحت المناظرة عن طريق الكي ثنائي القطب من pedicle السفينة والاستئصال اللاحقة مع مقص صغير. إزالة العضلات الحق sternocleidomastoid عبر الكي ثنائي القطب من الجزء العلوي والسفلي والاستئصال اللاحقة مع مقص صغير للوصول إلى الشريان السباتي المشترك.
تعبئة الشريان السباتي المشترك بقدر ما distally و proximally ممكن عن طريق سحب الأنسجة الضامة المحيطة بها وبصرف النظر مع ملقط غرامة. التعادل اثنين من 7-0 خيوط الحرير مع الحد الأدنى من المسافة بين بعضها البعض حول منتصف الشريان السباتي المشترك، وعابرة الشريان السباتي المشترك مع مقص دقيق الدقيقة بين الأربطة. مرر الطرف القريب من الرباط من خلال الكفة وإصلاحها بمشبك شريان صغير.
إزالة الرباط مع مقص دقيق صغير أقرب إلى الرباط قدر الإمكان ومسح التجويف مع المالحة heparinized مع إبرة قياس 30 مع الحرص على عدم تلف جدران السفينة. Distend التجويف مفتوحة باستخدام توسع الأوعية الدموية غرامة وعكس جذع السباتي على الكفة عن طريق سحبه بلطف على أنبوب البولي أميد. إصلاح فورا السباتي المقلوب مع فضفاضة قبل تعادل حلقة الحرير 7-0.
إجراء نفس الإجراء على الطرف الآخر من الشريان السباتي مع الكفة الأخرى. مرر نهاية الرباط من خلال الكفة واصلحها بمشبك شريان صغير. إزالة الرباط مع مقص دقيق صغير أقرب إلى الرباط قدر الإمكان ومسح التجويف مع المالحة heparinized مع إبرة قياس 30 مع الحرص على عدم تلف جدران السفينة.
Distend التجويف مفتوحة باستخدام توسع الأوعية الدموية غرامة وعكس جذع السباتي على الكفة عن طريق سحبه بلطف على أنبوب البولي أميد. إصلاح فورا السباتي المقلوب مع فضفاضة قبل تعادل حلقة الحرير 7-0. وضع الحيوان المتلقي جانبا وترطيب الثلثين العلوي مع المالحة حتى يتم explanted الجزء الأبهري.
تخدير الماوس المانح بنفس الطريقة التي يتم بها الحيوان المتلقي. قص جميع شعر منطقة البطن والصدر بقصة شعر كهربائية للحيوانات الصغيرة وتطبيق مرهم العيون مع مسحات القطن لمنع جفاف العينين أثناء الإجراء. وضع الحيوان في موقف supine على وسادة التدفئة تحت المجهر وشريط بلطف ساقيه إلى طاولة التشغيل مع شرائط الجص الحساسة للجلد.
فرك حقل المنطوق عدة مرات مع الكحول. إجراء استئصال البطن في منتصف الخط مع مقص صغير ودفع الأمعاء إلى أعلى قليلا لفضح الكافا الوريدي السفلي. حقن IVC مع مكعب واحد من الملحية heparinized باستخدام إبرة قياس 30.
قطع الشريان الأورطي البطني و IVC تحت الشرايين الكلوية مع مقص صغير لssanguinate الحيوان المانح. ضع ضغطًا فضفاضًا في البطن لامتصاص الدم. إجراء استئصال الصدر عن طريق تحويل ثنائي من الأضلاع مع مقص وإمالة جدار الصدر الأمامي بقشري مع المشبك الجراحي لفضح الميديستينوم.
قطع IVC والمريء مباشرة فوق الحجاب الحاجز مع مقص صغير. إزالة القلب والرئتين عن طريق التمليك لهم صعودا مع ملقط عقد قطع IVC والمريء ومن ثم استئصالها مع مقص صغير من القاعدة للوصول إلى الشريان الأورطي الصدري وmediastinum الظهرية. تعبئة الشريان الأورطي الصدري من الأنسجة المحيطة بها عن طريق سحب بعيدا الأنسجة الضامة المحيطة والدهون مع ملقط غرامة مع الحرص على عدم تلف أي الشرايين الوربية.
الكي جميع الفروع من الشريان الأورطي الصدري مع ملقط كوتري ثنائي القطب واستئصال الجزء الأبهري بين الحجاب الحاجز وقوس الأبهر باستخدام مقص صغير. دافق الجزء الأبهري المُخَطَل مع محلول ملحي مُهدَّد مع إبرة قياس 30 مع الحرص على عدم إتلاف جدران الوعاء لإزالة أي دم أو جلطات متبقية ونقل الكسب غير المشروع إلى الحيوان المتلقي. سحب الطرف القريب من الجزء الأبهري المانحة على الكفة القريبة على رأس الشريان السباتي المقلوب مع ملقط غرامة وإصلاحه على الفور مع حلقة الحرير فضفاضة قبل تعادل 7-0.
تقليم نهاية حرة من الكسب غير المشروع الأبهري مع مقص صغير بحيث طول الكسب غير المشروع يناسب المسافة بين الأصفاد اثنين. سحب نهاية القعدة من الجزء الأبهري المانحة على الكفة القعدة على رأس الشريان السباتي المقلوب مع ملقط غرامة وإصلاحه على الفور مع حلقة حريرية فضفاضة قبل تعادل 7-0. إزالة المشبك القاصي أولاً للسماح بالضخ الرجعية.
بعد تحقيق الهدسات، وإزالة المشبك القريبة لإكمال تناسلية. وأخيرا، أغلق الجرح مع خياطة مستمرة 6-0. بعد 28 يوما، يتم التضحية بالحيوانات والحفاظ على الطعوم لتلطيخ النسيج.
كما هو مبين في هذه البقع فان غيسون من المقاطع الأبهري، تماما MHC غير متطابقة الأورعا allografted من Balb / c المانحين إلى ستة متلقين السود وضعت تضخم نيوينيمي كبير مما أدى إلى تضييق الإنارة. من ناحية أخرى ، وضعت عمليات زرع الأبهري سينجيني من المتبرعين الستة السود إلى ستة متلقين أسود فقط تضخم التنسج الجديد قليلا. يُظهر التلطيخ المناعي ضد SM22، وهو علامة لخلايا العضلات السلسة الوعائية، كما هو موضح في هذه الصورة في الفلورس الخضراء، أن النيوريسما يتكون بشكل رئيسي من خلايا العضلات السلسة الوعائية.
يعمل زرع المورين الأبهري كنموذج لاعتلال الأوعية الدموية المزمن الذي هو السبب الأكثر شيوعًا لفشل الكسب غير المشروع في وقت متأخر. بالمقارنة مع نموذج البطن التقويمي، لدينا تقنية الكفة المعدلة هي أقل تطلبا microsurgical مما يؤدي إلى نسبة نجاح عالية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لقطر الكفة الثابت ، يمكن إهمال الاختلافات في أوعية الأوعية الدموية كما هو مُشاهد في نماذج زرع الأعضاء المجهرية الأخرى.
وعلاوة على ذلك، يتم الاحتفاظ الوقت التروية الدافئة ثابتة في جميع أنحاء المجموعات التجريبية كما يتم إعداد الحيوان المتلقي أولا قبل أن يتم explanted الجزء الأبهري. وينبغي أن نموذجنا المعدلة تساعد مختبرات أخرى على إنشاء زرع مورين الأبهري.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لعملية زرع الشريان الأبهر في موقع غير متجانس في الفئران باستخدام تقنية الغمد غير الخياطية. تم تصميم هذا النموذج الفأري العنقي لدراسة اعتلال الأوعية الدموية المزمن في الطعم الخيفي (CAV) وتقييم العوامل العلاجية الجديدة لمنع تكونه.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- بيولوجيا زراعة الأعضاء
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- الجراحة التجريبية
خلفية علمية
- يُعد اعتلال الأوعية المزمن في الطعم الخيفي (CAV) من المضاعفات الخطيرة في عمليات الزرع.
- يمكن أن يؤدي فهم اعتلال الأوعية المزمن في الطعم الخيفي إلى استراتيجيات علاجية أفضل.
- تعتبر النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة الأمراض المرتبطة بالزرع.
- توفر تقنية الغمد غير المخيطة نهجاً جديداً لزرع الشريان الأورطي.
الغرض من الدراسة
- تقديم نموذج فأري موثوق لدراسة اعتلال الشرايين الناجم عن الرفض (CAV).
- تقييم فعالية العوامل العلاجية الجديدة في الوقاية من اعتلال الشرايين الناجم عن الرفض (CAV).
- تحسين التقنيات الجراحية في أبحاث زراعة الأعضاء.
الطرق المستخدمة
- تخدير الفئران المستقبلة باستخدام midazolam وmedetomidine وfentanyl.
- تجهيز موقع الجراحة عن طريق قص الشعر ووضع مرهم عيني.
- وضع الحيوان على وسادة تدفئة لضمان الظروف الجراحية المثالية.
- استخدام تقنية الغمد غير المخيطة لزراعة الشريان الأبهر.
النتائج الرئيسية
- تسهل تقنية الغلاف غير المخطوط بنجاح عملية زرع الشريان الأورطي.
- يسمح هذا النموذج بتقييم تطور تضيق الوريد الوربي (CAV).
- يمكن تقييم العوامل العلاجية المحتملة باستخدام هذا النموذج.
- يمكن تحقيق فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية لـ CAV من خلال هذا النهج.
الاستنتاجات
- يُعد النموذج المقدم أداة قيمة لدراسة CAV.
- قد يؤدي هذا النموذج إلى تطورات في الاستراتيجيات العلاجية للمرضى الذين خضعوا لعمليات زراعة الأعضاء.
- من شأن إجراء المزيد من الأبحاث باستخدام هذا النموذج أن يعزز فهمنا لبيولوجيا زراعة الأعضاء.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال اعتلال الأوعية المزمن في الطعم الخيفي (CAV) سبباً رئيسياً لفشل الطعوم على المدى الطويل في عمليات نقل الأعضاء الصلبة، مع وجود خيارات علاجية محدودة نظراً للفهم غير المكتمل لفيزيولوجيته المرضية. يوفر نموذج نقل الشريان الأورطي العنقي في الفئران، والذي يستخدم تقنية الغمد المعدلة غير المعتمدة على الخياطة، منصة جراحية مجهرية بسيطة وقابلة للتكرار لدراسة آليات اعتلال الأوعية المزمن وتقييم التدخلات المحتملة. ومن خلال تمكين إجراء مفاغرة وعائية متسقة والتحكم في زمن نقص التروية الدافئ، يدعم هذا النموذج الحد من المخاطر قبل السريرية للاستراتيجيات العلاجية التي تستهدف إعادة تشكيل الأوعية الدموية في عمليات النقل.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في الأمراض الوعائية من خلال نمذجة فرط تنسج الطبقة الباطنية الجديدة وتضيق اللمعة ذات الصلة بالبشر في الأبهر المزروع خيفياً.
- القيمة التشغيلية: توفر توصيلاً قياسياً خالياً من الغرز يقلل من التباين التقني ويدعم معدلات نجاح عالية عبر المجموعات التجريبية.
- القيمة التنبؤية: تسهل الحد من المخاطر البيولوجية للأهداف المشاركة في إعادة تشكيل الأوعية الدموية بوساطة خلايا العضلات الملساء، كما يتضح من تكوين طبقة باطنية جديدة إيجابية لـ SM22.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفر مخرجات قابلة للقياس الكمي —تضخم البطانة الجديدة وتضيق اللمعة— مما يتيح تقييم الاستجابة للجرعة للمركبات المرشحة في نظام مرتبط بالمرض.
- القيمة التشغيلية: تضمن جاهزية المقايسة من خلال قطر كم ثابت وتوقيت جراحي موحد، مما يقلل من المتغيرات المربكة المرتبطة بالتوصيل الوعائي.
- القيمة الانتقالية: تدعم جاهزية الفحص من خلال استخدام طعوم خيفية غير متوافقة تماماً مع معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) لمحاكاة الاستجابات المناعية الخيفية البشرية في فشل الطعوم الوعائية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يمثل اعتلال الأوعية الدموية المزمن في الطعوم الخيفية كمرض تدريجي، مما يسمح بالتقييم الطولي للتغيرات في الطعم حتى 28 يوماً بعد الزرع.
- القيمة التشغيلية: يتيح التحليل النسيجي والفلورة المناعية (مثل صبغ Van-Gieson، والكشف عن SM22) للتحقق من الارتباط بالهدف وآلية العمل.
- القيمة التنبؤية: يدعم قرارات التطوير المعدلة حسب المخاطر من خلال التمييز بين استجابات الطعوم المتماثلة جينياً (تضخم أدنى) والطعوم الخيفية (تضخم ملحوظ).
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
يتناسب هذا النموذج ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى التقييم قبل السريري، لا سيما بالنسبة للعلاجات التي تهدف إلى تثبيط تكاثر العضلات الملساء الوعائية أو تعديل الإصابة الوعائية بوساطة مناعية في عمليات الزرع.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات حول المسارات التي تؤدي إلى تكون الغشاء المبطن الجديد (neointima)، مما يتيح تقليل المخاطر الميكانيكية قبل تحسين المركب الرائد.
- الفحص: توفر نتائج وعائية كمية وقابلة للتكرار، مما يجعلها مناسبة لفحص مكتبات المركبات في نموذج جراحي موحد.
- التحليلات: تولد نقاط نهاية قابلة للقياس — مثل مساحة اللمعة، وسماكة الغشاء المبطن الجديد، والتعبير عن علامات العضلات الملساء — مما يتيح إجراء تحليل مقارن بين مجموعات العلاج.
- الأبحاث الانتقالية: تحاكي الفسيولوجيا المرضية لمرض CAV البشري، مما يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من العوامل الواقية للأوعية الدموية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة جراحية قابلة لإعادة الاستخدام لعدة أنماط علاجية (الجزيئات الصغيرة، والمواد البيولوجية، والعلاجات الجينية) التي تستهدف إعادة تشكيل الأوعية الدموية في سياقات زراعة الأعضاء.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال نمذجة سبب ذي صلة سريرياً لفقدان الطعم المتأخر مع مخرجات نسيجية ووظيفية محددة.
- القيمة التشغيلية: تحسين القابلية للتكرار وتقليل التباين بين الحيوانات من خلال تقنية الغمد غير المعتمدة على الخياطة الموحدة وظروف جراحية محكومة.
- القيمة الاستراتيجية: توجيه قرارات المضي قدماً من عدمه من خلال تقديم أدلة مبكرة على الفعالية في منع إعادة التشكيل الوعائي المرضي، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: تمكين تحديد الأولويات للمرشحات التي تستهدف الأوعية الدموية بناءً على تقسيم المخاطر، وذلك وفقاً لقدرتها على تثبيط فرط تنسج البطانة الداخلية في نموذج طعم خيفي ذو كفاءة مناعية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات الجراحة المجهرية، بما في ذلك عزل الأوعية الدموية، والربط، والقلب باستخدام ملاقط دقيقة ومقصات مجهرية.
- يعتمد على أدوات متخصصة مثل موسعات الأوعية الدموية، وأنظمة غسيل بالمحلول الملحي المضاف إليه الهيبارين، ومجاهر ستيريو لإجراء عملية المفاغرة بدقة.
- يستلزم رعاية موحدة بعد الجراحة وتحديد وقت التضحية بالحيوان (على سبيل المثال 28 يوماً) لضمان تقييم متسق لتطور اعتلال الأوعية الدموية المزمن.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التوسع في استخدام سلالات مختلفة من الفئران أو أحجام مختلفة من الطعوم، على الرغم من أن أبعاد الغمد تساعد في الحفاظ على اتساق المفاغرة.
- يقتصر على نمذجة اعتلال الأوعية الشريانية؛ حيث تتطلب تخثر الأوردة أو الأمراض القلبية المحددة نماذج تكميلية.
