طريقة عالية الإنتاجية في الموقع لتقدير البليدي النووي الكبدي في الفئران

هذه الطريقة تمكن المستخدم من توليد لمحة عن محتوى الحمض النووي الكبد من أقسام الأنسجة 2D لدراسة تطوير الكبد، والتجدد، والأمراض المزمنة. ويمكن تطبيق هذا النهج الإنتاجية العالية الآلي على جميع أقسام أنسجة الكبد 2D، وتوفير قراءات معايرة داخليا من ploidy النووية لجميع نويات الكبد الدائرية بسيطة. وترتبط التغيرات في ploidy النووية الكبدية مع الشيخوخة, أمراض الكبد المزمنة, والسرطان.

هذه التقنية توفر وسيلة بسيطة لملف ploidy النووية في عينات الكبد ثابتة أو cryopreserved. في الموقع طرق التنميط ploidy لديها إمكانات كبيرة كالبحوث والأدوات السريرية لتتبع تطور أمراض الكبد لأنها لا تتطلب إزالة التصنيف العنصري الأنسجة أو الوصول إلى المواد الجديدة. بعد حصاد العينة أنسجة الكبد مورين, تضمين فصوص الكبد في درجة حرارة قطع الأمثل مملوءة المبردة وضع القالب على الفور على الجليد الجاف لضمان التجميد السريع.

للحصول على شرائح من عينة الفصوص الكبد المجمدة، مقطع العينة بسمك ستة ميكرومتر، ووضع شريحة مطلية بالبولي أميد المغلفة على كل عينة لمدة خمس ثوان للسماح لكل عينة عصا الشريحة. عندما يتم جمع جميع الشرائح ، والسماح للعينات لتكلس لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل immunolabeling. في نهاية التوازن، وإصلاح أقسام الأنسجة في غطاء الدخان مع ملليلتر واحد من 4٪ شبهفورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية التثبيت ، شطف الشرائح مع ثلاث يغسل ثلاث دقائق في برنامج تلفزيوني مع التحريض لطيف. بعد الغسيل الأخير، جفف المنطقة المحيطة بكل قسم من الأنسجة واستخدم قلمًا محمّلًا لرسم دائرة حول كل عينة. ل Permeabilize العينات، وعلاج المقاطع مع السطح 0.5٪ غير الأيونية في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، وغسل العينات لمدة ثلاث دقائق في برنامج تلفزيوني مرتين مع التحريض لطيف كما هو موضح قبل منع الربط غير محددة مع محلول المصفاة من 1٪ البوم البقرية، 5٪ مصل الحصان، و 0.2٪ السطح غير الأيونيك في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة HHF4-ألفا المخففة في عازلة منع بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في غرفة تلطيخ رطبة محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي ، وغسل الشرائح أربع مرات في برنامج تلفزيوني مع التحريض لطيف قبل الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي الفلوري المناسب وHoechst المخفف في تصفية 1 ٪ البوم البقرية و 0.2 ٪ غير الأيونيك السطحي في برنامج تلفزيوني لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة تلطيخ رطبة محمية من الضوء.

في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح أربع مرات كما هو موضح، تليها اثنين من يغسل ثلاث دقائق في الماء المقطر مزدوجة مع الانفعالات لطيف. بعد الغسيل الأخير، قم بتركيب العينات مع قطرتين من الفلوريسنس المتصاعد المتوسط على غطاء، وطبق ضغط لطيف عند الضرورة للقضاء على أي فقاعات. ثم، تحقق من الشرائح باستخدام المجهر الفلوري التقليدي لضمان التثبيت الجيد والمناعة.

للحصول على صورة الفلوريسنس، قم بتعيين المعلمات على منصة تصوير عالية المحتوى للحصول على صور الفلورسينس باستخدام الإثارة المناسبة للفلوروفوريس المستخدمة. ثم مسح العينات للحصول على صور كافية للحصول على تغطية كاملة من قسم الأنسجة. في نهاية المسح، ضبط المعلمات تجزئة النووية من البرنامج لضمان أن يتم عزل النوى على النحو الأمثل وتعديل كثافة عتبة لضمان البوابات الأمثل من خلايا الكبد الإيجابية HNF4-ألفا وHNF4-ألفا السلبية غير parenchymal الخلايا.

بالنسبة للكمية النووية، تعيين المنطقة النووية في ميكرومتر مربع على أساس تلطيخ Hoechst، وكثافة هويشست النووية الرئيسية، وعامل استطالة النووية، ومؤشر التقريب النووي المتوسط، وحالة HNF4-alpha، وإحداثيات X النووية، Y على أساس مركز الثقل. لإجراء تحليل ploidy النووية hepatocyte، أولا تحميل وتثبيت برنامج تحليل الكم ploidy. في MATLAB، انتقل إلى علامة التبويب التطبيق من قطاع الأدوات وانقر فوق تثبيت التطبيق.

افتح برنامج تثبيت تطبيق Ploidy ML. ستظهر رسالة لتأكيد التثبيت الناجح. في كل ملف تحليل البيانات، وتشمل ورقة يطلق عليها، قياسات الخلية، التي تحتوي على جميع البيانات المطلوبة لتحليل ploidy المنصوص عليها في الأعمدة كما هو مبين.

بالنسبة لكل حالة تجريبية، قم بتوفير مجموعة بيانات تحكم سيتم استخدامها لحساب الرقابة الداخلية لمعايرة ploidy النووية من اثنين إلى أربعة N. للنسخ المتماثلة البيولوجية، قم بتخزين كل جدول بيانات في المجلد الخاص به، وتسمية بادئات المجلد بشكل متزايد. بعد ذلك، إطلاق تطبيق Ploidy.

ستظهر واجهة المستخدم الرسومية للتطبيق Ploidy. انقر فوق الزر المسار إلى التحكم البيانات للانتقال إلى المجلد الذي توجد فيه النسخ المتماثل لبيانات عنصر التحكم. ثم يظهر مسار البيانات هذا في الواجهة.

في بادئة المجلد، اكتب الاسم الذي سيتم إعطاؤه لملفات الإخراج. انقر فوق الزر مسار إلى بيانات أخرى وانتقل إلى المجلد الذي توجد فيه النسخ المتماثلة البيانات المقارنة. ثم يظهر مسار البيانات هذا في الواجهة.

ثم انقر فوق تشغيل. عند اكتمال التحليل، سيقرأ شريط المعلومات تحليل "اكتمال". بعد التميّز المناعي، من المهم التحقق من جميع الشرائح بواسطة المجهر المفلوري التقليدي للتأكد من أنه تم الحصول على تثبيت وتلطيخ جيد.

يمكن أن يشير تشويه أو طمس صبغة Hoechst إلى عدم كفاية التثبيت أو تحلل العينة قبل التثبيت. وينبغي تحسين بارامترات العزل النووي وبارامترات عتبة HNF4-alpha بعناية قبل التحليل التلقائي للصور بحيث تعكس على نطاق واسع النمط البصري للمناعة التي لوحظت عن طريق المجهر المفلور. بعد تحليل الصورة، ينبغي أن تعكس البيانات الأعداد المتزايدة من الخلايا غير البارينشية والحد الصغير، ولكن الكبير، في أرقام النوى الإيجابية HNF4-alpha داخل الكبد مع إصابة DDC.

في الكبد التحكم الصحي, ما يقرب من 63٪ من النوى الإيجابية HNF4-ألفا يحمل morphometry دائري بسيط. وينبغي أن تعكس المقارنة بين اللواطي النووية النسبية بين مجموعات التحكم ومجموعات المعالجة المعالجة من DDC خسارة كبيرة في 2C و 4C من كريات الكبد مع الإصابة مع زيادة أعداد الخلايا الأكبر من 8C. يمكن استجواب المعلومات الموضعية النسبية لكل مجموعة فرعية من ploidy عن طريق استرداد الموقع 2D من مجموعات فرعية كبدية معينة ضمن برنامج تحليل الصور عالي المحتوى.

يمكن إجراء التلقيح المناعي مع أجسام مضادة إضافية ، مثل Ki-67 ، لتقييم تكرار الخلية ويمكن استجواب بيانات القياس المورفين النووي الكبدي لمزيد من الاستجواب لتكملة التحليل ploidy. يصف ملف تعريف ploidy على نطاق الأنسجة التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الطريقة الحد الأدنى من محتوى الحمض النووي لجميع نوات الكبد الدائرية ، ولكنه لا يميز بين الخلايا أحادية النوى والخلايا الكبدية binuclear. ويمكن أن تكون الطريقة قد تكييفها لحساب المعلمات مثل محيط الخلية، لتسهيل تحديد الخلايا الثنائية وتوفير قراءات إضافية من ploidy الخلوية.