تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الأساسية حول ديناميكيات الخلايا السلف العصبية وذريتها التي تكمن وراء نمو الدماغ الفقاري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تصور مجموعات متعددة مباشرة من الخلايا المرتبطة كلونالي داخل الدماغ الحي على مدى ساعات عديدة من التنمية. ويمكن أيضا تطبيق البروتوكول على دراسة ديناميات الزمر والنسل في النظم النامية الأخرى للجنين الحمار الوحشي.

التصور باستخدام هذه الطريقة مفيد بشكل خاص لمراقبة العمليات الأساسية التي تحدث أثناء التطور العصبي مباشرة. بعد الظهر قبل إجراء الحقن الدقيقة، إعداد البرية نوع حمار وحشي الكبار في الجنس فصل خزانات التزاوج. في صباح اليوم التالي إعداد حل الحمض النووي وفقا لاتجاهات المخطوطات وحقن ما يقرب من 4.2 لتر نانو من هذا الحل في خلية واحدة من الأجنة حمار وحشي في غضون 45 دقيقة من الإخصاب.

الحفاظ على الأجنة المحقونة في E ثلاثة متوسطة وحاضنة 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، ثم استدعاء الأجنة الميتة والمشوه من المجموعة. نقل ما يصل إلى 20 أجنة صحية في أنبوب 50 ملليلتر، وملء مع 10 ملليلتر من E ثلاثة ووضع غطاء على رأس كل أنبوب. ضع رفًا مع أنابيب 50 ملليلتر تستقيم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 80 إلى 90 دقيقة ، مع التأكد من أن مستوى الماء في الحمام أعلى من E ثلاثة في الأنبوب.

إزالة رف أنبوب من حمام الماء ووضعها في حاضنة 28 درجة مئوية. السماح لمدة تصل إلى ساعة واحدة لE ثلاثة لتبرد والأجنة لإعادة مناخ إلى درجة الحرارة. ثم نقلها إلى أطباق بيتري مع 0.2 ملليمولار PTU و E ثلاثة أبقى دافئة في حاضنة 28 درجة مئوية.

في ساعتين إلى أربع ساعات بعد الصدمة الحرارية، فحص الأجنة تحت مجهر تشريح الفلوريسنس القياسية للتعبير عن CFP أو YFP الذي يشير إلى إعادة الكومبونيشن Brainbow ناجحة. حدد الأجنة مع التعبير FP قوية في جميع أنحاء ونقلها إلى طبق منفصل مع PTU. صورة لهم واحد، اثنين، أو ثلاثة أيام بعد الإخصاب.

التعبير الذي يظهر خافت تحت المجهر الفلوري قد يكون في الواقع تصورا جيدا في التصوير الفاصل الزمني confocal. قبل يوم التجربة، قم بإعداد غرفة التصوير وأداة التلاعب بالأجنة. لإعداد غرفة التصوير، قم بغرم حلقة بلاستيكية بعناية إلى مركز طبق بيتري عيار 60 ملليمترًا.

بناء المتلاعب من قبل السوبر الإلتصاق طول صغير من خط الصيد النايلون إلى نهاية عصا مسحة خشبية أربعة بوصة. إذا لزم الأمر، ابطل الأجنة تحت مجهر تشريح قبل التركيب. لتركيب الأجنة، نقل الأسماك إلى مركز حلقة بلاستيكية في غرفة التصوير وإزالة أكبر قدر من فائض E ثلاثة ممكن مع ماصة نقل يميل غرامة.

استخدام ماصة نقل نظيفة لتغطية الأسماك مع واحد في المئة تذوب أقل agarose وE ثلاثة، وملء حلقة بلاستيكية كاملة مع طبقة من agarose. ثم سحب بلطف الجنين حتى في طرف ماصة والعودة إلى agarose دون إدخال أي فقاعات الهواء. استخدم متلاعبًا بالجنين لتوجيه الأسماك والأغاروز بسرعة قبل أن تصلب.

إذا التصوير مع المجهر تستقيم، وضع الجنين أقرب إلى السطح العلوي من agarose ممكن، والتأكد من أنها موازية إلى الجزء السفلي من غرفة التصوير مع ذيلها على التوالي. انتظر حتى تصلب agarose ، ثم ملء غرفة التصوير مع E ثلاثة ، مضيفا قدر الإمكان لحساب التبخر على مدى التصوير. ضع غرفة التصوير مع السمك و E ثلاثة على المجهر confocal.

ثم حدد الهدف مع فتحة رقمية عالية ومسافة عمل طويلة. ابحث عن منطقة بها علامات كثيفة ومشرقة للخلايا بشكل مناسب، واضبط معلمات الاستحواذ. هذا مثال باستخدام برنامج Zen، ولكن تختلف الإعدادات وفقًا للمجهر وخطوط الليزر المتاحة.

إعداد ثلاثة مسارات لصورة كل قناة FP بالتسلسل. استخدام ليزر الأرجون لإثارة CFP في 458 نانومتر وYFP في 514 نانومتر، واستخدام ليزر DPSS 561 نانومتر لإثارة dTomato. جمع البعثات للثلاثة في الأطوال الموجية المناسبة.

حدد نطاق المكدس Z إلى الصورة وفاصل زمني بين 10 و 30 دقيقة لتعقب الأحداث mitotic و apoptotic. وأخيراً، حدد طول جلسة التصوير وقم بتشغيل التجربة. بعد اكتمال التصوير، احفظ البيانات الخام بتنسيق CZI إذا كان يستخدم Zen أو تنسيق آخر متوافق مع فيجي، ثم قم باستيراد الصور إلى فيجي باستخدام مستورد التنسيقات الحيوية.

في التصوير متعدد الألوان في الجسم الحي تم استخدام التصوير الفاصل الزمني لإظهار استنساخ لون Brainbow مرمز من الخلايا في منطقة البطين التكاثرية من حمار وحشي النامية hindbrain. Brainbow تسمية الخلايا مرتبة على طول ألياف شعاعية معينة مشتركة نفس اللون. والتي يمكن قياسها كمًا كأوزان قناة RGB النسبية.

وهذا يشير إلى أن هذه المجموعات الإذاعية كانت مستنسخة من خلايا مقسمة وأن لونها المماثل يمكن استخدامها للتعرف عليها على أنها ذات صلة بالكلونلي. وأظهر تحليل اللون الكمي أن الخلايا ابنة التعبير عن نفس لون الخلية الأم. ولكن يمكن تمييز مجموعات الراديو المجاورة من الخلايا عن بعضها البعض.

ويمكن أن تتبع العديد من استنساخ الخلايا ذات الصلة في وقت واحد على مدى ساعات في الجسم الحي، مما يسمح لتحليل نسب متعددة والمقارنة. أظهر القياس الكمي للتعبير اللوني في النسخ في اثنين ثم مرة أخرى في ثلاثة أيام بعد الإخصاب أن التعبير Brainbow ظلت ثابتة نسبيا من يومين إلى ثلاثة أيام. كشف التصوير الفاصل الزمني عن العديد من الخلايا التي تمر بالهجرة النووية المتداخلة وتقسيم الخلايا من يوم إلى يومين بعد الإخصاب ، مما يجعل من الممكن دراسة دورة الخلية.

تم حساب متوسط دورة الخلية 8.4 ساعة وهو مماثل للقياسات السابقة في سمك الحمار الوحشي. وعلاوة على ذلك، تم استخدام تقنية التصوير هذه لمراقبة الخلايا الفردية التي تمر بالتغيرات المورفولوجية النمطية المرتبطة بالخلايا المبرمجة، مثل غشاء الغشاء وتفتيت الخلايا. ونظرًا لأن هذه الطريقة تتم في الجسم الحي، يمكن إنقاذ أسماك الحمار الوحشي من غرفة التصوير والحفاظ عليها للتصوير أو إجراء تجارب أخرى في وقت لاحق.

استخدام هذه التقنية يسمح لنا لاستكشاف أسئلة جديدة حول أدوار الخلايا المرتبطة كلونالي خلال التنمية العصبية.