القياس الكمي للنض المعدني في الفصل اللوني لتقارب المعادن
يناير 17, 2020
نقدم فحصا للقياس الكمي السهل للمعادن التي تم إدخالها علي العينات المعدة باستخدام الكروماتوغرافي اللوني لتقارب المعادن. يستخدم الأسلوب هيدروكسينفثول الأزرق كما مؤشر المعادن اللونية والاشعه فوق البنفسجية-فيس الطيفية ككاشف.
طريقتنا هامة، لأنها تسمح لمتوسط الكيمياء الحيوية بتحديد ما إذا كانت العينات المعزولة باستخدام الكروماتوغرافيا المعدنية المُشلَّة ملوثة بالمعادن الانتقالية. الميزة الرئيسية هي السهولة التي يمكن بها إجراء الفحص. يستخدم المقايسة الأجهزة والتقنيات الشائعة في معظم مختبرات الكيمياء الحيوية ، ويمكن تنفيذه بسهولة وبسرعة.
بينما في هذه المقالة ونحن تطبيق هذه الطريقة للعينات معزولة مع عمود النيكل NTA، يمكن استخدام الأسلوب مع أي راتنج تقارب المعادن الأخرى. يجب على المستخدمين المرة الأولى محاولة هذا الأسلوب مع حل مخزون النيكل من التركيز المعروف. هذا وسوف أطلعهم على سير العمل ، والألوان عينة ، والراتنجات هو مبين في التغيرات الطيفية.
إثبات الإجراء سيكون كول سوين، فني من مختبري. للبدء، تشغيل واحماء مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس. تحديد كسور الكروماتوغرافيا التي سيتم تحليلها باستخدام مقياس طيفي للأشعة فوق البنفسجية UV-Vis مع الامتصاص البصري عند 280 نانومتر لقياس البروتين.
الحصول على 10 إلى 100 ميلليمولار عينة العازلة مع PH بين 7 و 12، مثل تريس، HEPES، MOPS، والمخزن المؤقت الفوسفات. إعداد 12٪ الوزن من قبل محلول حجم تشتت HNB في المخزن المؤقت عينة باستخدام 120 ملليغرام من كاشف HNB لكل ملليلتر من حل المخزون المعدة. قم بتعيين مقياس الطيف لجمع البيانات عند 647 نانومتر.
استخدام cuvette الكوارتز مليئة المخزن المؤقت عينة لفراغ الطيفي. إعداد حل التحكم في cuvette تحتوي على 50 ميكرولترات من مخزون HNB لكل ملليلتر من إجمالي حجم المعايرة. السماح لعنصر التحكم لاحتضان لمدة لا تقل عن ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قياس وتسجيل امتصاص في 647 نانومتر لعينة التحكم. إعداد عينات من الفحص عن طريق خلط 150 ميكرولترات من المخزون HNB مع 2850 ميكرولترات من كسور البروتين المخففة بشكل مناسب مع المخزن المؤقت للعينة. السماح للعينة لاحتضان لمدة لا تقل عن ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
كرر تسجيل الطيف لكل كسر يتم قياسه. في حالة عدم كفاية الحصول على التخفيف ، فإن النطاق الطيفي بأكمله في 647 نانومتر ذهب. بينما مع تخفيف قوية جداً، العينة لا يمكن فصلها عن عنصر التحكم.
لتحديد تركيز المعدن في كل عينة، ابحث أولاً عن الفرق بين كل امتصاص للعينة عند 647 نانومتر من عنصر التحكم في HNB. تحديد تركيز المعادن في micromolar باستخدام الصيغة حيث DF هو عامل التخفيف لكسر مقايسة، دلتا A-B-S 647 هو تغيير امتصاص في 647 نانومتر، 3.65 مرات 10 إلى 2 السلبية يمثل معامل الانقراض من HNB، وL هو المسار الضوئي cuvette في السنتيمتر. في هذه الدراسة، يتم عرض الطيف من HNB الحرة في PH محايدة في أطياف تمثيلية من الكسور المقايسة لأيون النيكل من عزل MSP1E3D1 هنا.
لوحظ انخفاض في امتصاص 647 نانومتر مقارنة مع السيطرة HNB ، والتي تتوافق مع تشكيل HNB المجمعات في وجود معدن انتقالي. لإثبات تطبيق هذا الفحص ، تم تحليل اثنين من بروتينات سقالة الغشاء الموسومة له ، MSP1E3D1 ، MSP2N2 ، ورواية ، ثلاثة هيمي ، c-type cytochrome GSU0105 ، من الكبريتريدين الجيوبتري. تم تحويل محتوى أيونات البروتين والنيكل لكل جزء من GSU0105 بشكل كبير من بعضها البعض ، في حين أن الكسور لMSP1E3D1 وMSP2N2 التي تحتوي على معظم البروتين كان لها أعلى محتوى النيكل.
ومن الواضح أيضا أن المحتوى المعدني قد لا يكون موزعا بالتساوي بين الكسور التي تم جمعها باستخدام اللوني تقارب المعادن المعبأة. ومن المهم أن مزج بشكل كاف وثابت فارغة في جميع العينات والسماح لأوقات حضانة متساوية للفارغة في جميع العينات. ويمكن تحليل كسور البروتين ذات الاهتمام الخاص بمزيد من التحليل باستخدام قياس طيف الامتصاص الذري أو ICPMS لتأكيد التلوث المعدني واختبار أيونات البروتين المعدنية المُثبَّتة أو المقيدة بقوة.
وإلى جانب عملية الانتقال الكشف عن الرشح المعدني، يمكن استخدام هذه التقنية لقياس القرابة الملزمة في أيونات المعادن الانتقالية إلى البروتينات. HNB وأي النيكل الموجودة في العينات هي المهيجات للعيون والجلد على التوالي. وينبغي استخدام معدات الوقاية الشخصية القياسية بما في ذلك القفازات وحماية العين أثناء هذه الطريقة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة مقايسة بسيطة لتقدير كمية المعادن في العينات التي تم تحضيرها باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للمعدن المثبت. تعتمد هذه الطريقة على استخدام صبغة هيدروكسي نافثول بلو كمؤشر لوني، وتستخدم مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV-Vis spectrophotometer) للكشف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- الكيمياء التحليلية
- كروماتوغرافيا الألفة للمعادن
خلفية علمية
- يمكن أن يؤثر تلوث العينات بالمعادن الانتقالية على النتائج التجريبية.
- يعتبر كروماتوغرافيا الألفة للمعادن المثبتة تقنية شائعة في الكيمياء الحيوية.
- قد تكون الطرق الحالية للكشف عن التلوث المعدني معقدة أو تتطلب معدات متخصصة.
- هناك حاجة إلى طريقة بسيطة ومتاحة للتحليل الروتيني في مختبرات الكيمياء الحيوية.
الغرض من الدراسة
- توفير اختبار مباشر للكشف عن التلوث بالمعادن في العينات.
- تمكين علماء الكيمياء الحيوية من تقييم نقاء العينة بسرعة.
- تسهيل استخدام معدات المختبر الشائعة لتقدير كمية المعادن.
الطرق المستخدمة
- استخدام هيدروكسي نافثول الأزرق كمؤشر لوني.
- تطبيق مطيافية الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV-Vis) للكشف.
- الاختبار باستخدام أعمدة النيكل-NTA وراتنجات ألفة معدنية أخرى.
- تجارب أولية باستخدام تراكيز معروفة من محاليل النيكل القياسية.
النتائج الرئيسية
- يتيح هذا المقايسة إجراء تقييم سريع للتلوث بالمعادن.
- يمكن الحصول على النتائج باستخدام تقنيات مختبرية قياسية.
- تتميز هذه الطريقة بقابليتها للتكيف مع مختلف راتنجات الألفة المعدنية.
- يمكن للمستخدمين التعرف على سير العمل من خلال التجارب الأولية.
الاستنتاجات
- يُبسط الاختبار المقترح عملية الكشف عن التلوث بالمعادن.
- يمكن لعلماء الكيمياء الحيوية العاديين الوصول إلى هذا الاختبار باستخدام معدات مختبرية شائعة.
- تعزز هذه الطريقة من موثوقية العينات التي تم تحضيرها عبر كروماتوغرافيا الألفة المعدنية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يؤدي تسرب المعادن من أعمدة كروماتوغرافيا الألفة المعدنية المثبتة (IMAC) إلى إدخال ملوثات من المعادن الانتقالية التي يمكن أن تثبط نشاط الإنزيم وتؤثر سلبًا على موثوقية المقايسة في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومتاحة لتقدير كمية هذا التلوث باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV-Vis) المتاحة على نطاق واسع وصبغة هيدروكسي نافثول الأزرق (HNB)، مما يتيح إجراء مراقبة روتينية للجودة دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة. ومن خلال توفير حساسية بمستوى النانومول باستخدام معدات المختبر القياسية، تدعم هذه المقايسة سلامة البيانات في المراحل المبكرة من التحقق من الأهداف وسير عمل تنقية البروتين.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: يتيح التحقق مما إذا كان تثبيط الإنزيم الملاحظ ناتجاً عن بيولوجيا الهدف أو عن تلوث معدني، مما يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة في عملية التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: يستخدم أجهزة مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV-Vis) الموجودة والمحاليل المنظمة الشائعة، مما يسمح بالتنفيذ السريع عبر فرق الاكتشاف دون الحاجة إلى استثمارات في معدات جديدة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر قراءات كمية لأيونات المعادن عند 647 nm، مما يسمح بربط مستويات الترشيح بنقاء الكسر في تنقية IMAC.
- القيمة التشغيلية: يوحد تقييم التلوث عبر مختلف متغيرات البروتين والراتنجات، مما يدعم تطوير مقايسات قابلة للتكرار لإنتاج البروتينات الموسومة بـ his-tagged.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- القيمة العلمية: تؤكد خلو البروتينات المنقاة من المعادن قبل إجراء المقايسات الوظيفية، مما يعزز الثقة التنبؤية في دراسات ارتباط الهدف اللاحقة.
- القيمة التشغيلية: توفر معياراً لإجازة دفعات البروتين، مما يتيح اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف قبل الالتزام باختبارات الفعالية قبل السريرية.
تكامل تدفق العمل والمسارات التحليلية
تأتي هذه الطريقة في المرحلة التي تلي التنقية باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للأيونات المعدنية (IMAC) وتسبق التوصيف البيوكيميائي أو البيوفيزيائي اللاحق، حيث تعمل كنقطة تحقق من نقاء العينة قبل إجراء دراسات حركية الإنزيمات، أو مقايسات الارتباط، أو الدراسات التركيبية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال استبعاد الآثار الاصطناعية التي تتوسطها المعادن في بيانات نشاط الإنزيم أو التفاعل البروتيني.
- الفحص: يضمن جاهزية المقايسة من خلال التحقق من أن كسور البروتين المنقاة خالية من المعادن الانتقالية المثبطة التي قد تؤدي إلى انحراف نتائج فحص المركبات.
- التحليلات: يولد قيم دلتا للامتصاص الكمي عند 647 nm، مما يتيح حساب تركيزات المعادن بالميكرومولار للمقارنة بين التشغيلات المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط جودة التنقية بالاستمرارية قبل السريرية من خلال ضمان عدم تسبب التلوث المعدني في إرباك عملية التحقق من الهدف أو قياسات المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يعمل كخطوة مراقبة جودة قابلة لإعادة الاستخدام وتطبق على أي تنقية تعتمد على IMAC، بغض النظر عن نوع الراتنج أو البروتين المستهدف.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الهدف عن طريق إزالة مصدر شائع للضوضاء البيوكيميائية في المقايسات القائمة على الإنزيمات.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوحيد القياسي بين المختبرات من خلال استخدام طريقة قياس لوني بمعايير حضانة وقياس محددة.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من مخاطر فشل التجارب بسبب تثبيط المعادن غير المكتشف، مما يحسن كفاءة رأس المال في حملات تحديد المركبات الرائدة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات للأهداف البروتينية بناءً على النقاء المؤكد مع تعديل المخاطر، مما يدعم تخصيصاً أفضل للموارد في مراحل الاكتشاف المبكرة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب الإلمام بمطيافية الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV-Vis) والتحضير الأساسي لمحاليل كاشف HNB.
- يعتمد على توفر كوفيتات الكوارتز وجهاز مطياف قادر على قياس الامتصاصية عند 647 nm.
- يستلزم اتساقاً في تخفيف العينات وتوقيت الحضانة لضمان دقة حسابات delta-AB.
- قد يتطلب تحسيناً للبروتينات ذات الامتصاصية الذاتية القوية أو التي تسبب تداخلاً لونياً عند 647 nm.
- يُفضل دمجه مع طرق متعامدة مثل AAS أو ICPMS للتأكيد عند الحاجة إلى تقدير كمي للمعادن بدرجة ثقة عالية.
