توطين والقياس الكمي لفيروسات البيجومو في أنسجة الذبابة البيضاء عن طريق الفلورة المناعية وPCR الكمي

ويمكن أن يساعد توضيح المكانية وكمية الفيروس في ناقلات الحمى البيضاء في فهم التفاعلات البيرغوموفيروس وايتفل وفي وضع استراتيجيات جديدة للسيطرة على الأمراض الخطيرة البغوموفيروسية. مزايا هذه التقنية هي أننا يمكن أن نعزل بسرعة أنسجة الفلعة البيضاء ، والمشاركة في توطين البروتينات الفيروسية والفلعة البيضاء ، وقياس الفيروسات في الأجسام البيضاء بأكملها والنباتات المصابة بالفيروسات. في الوقت المناسب في وقت تجريبي، بعد اكتساب الفيروس، ضع الذباب الأبيض الأنثوي المُجَبَّر في قطرة من برنامج تلفزيوني على شريحة مجهر واستخدم إبرة الوخز بالإبر الدقيقة لفتح بطن الذباب الأبيض تحت مجهر ستيريو.

استخدام إبرة لاستخراج midgut ووضع منتصف في طبق جمع من برنامج تلفزيوني. لجمع PSGs، وتقسيم الجسم في الصدر من الجانب الظهري بالقرب من الرأس وإصلاحرفل الأبيض مع إبرة من خلال الصدر. استخدام إبرة ثانية لهزة الفلات حتى يتم فصل الغدد اللعابية اثنين من الجسم ونقل الغدد إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني.

لجمع المبيضين، افتح البطن تمامًا واستخدم إبرة لفصل المبيضين عن الأنسجة الأخرى. استخدام ماصة لإزالة الأنسجة الزائدة ونقل المبيضين إلى طبق جديد من برنامج تلفزيوني. لجمع عينة من الهيموليم، إضافة 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني على شريحة مجهر جديدة ووضعرففلي جديد في قطرات.

استخدم إبرة الوخز بالإبر الدقيقة لإحداث ثقب في البطن. ثم تطبيق ضغط طفيف على البطن للافراج عن الهيمولى في المخزن المؤقت وجمع عينة من السائل ثمانية ميكرولتر. لتصور توطين TYLCV في حصادها whitefly PSG، midgut، أو أنسجة المبيض، ونقل 15 إلى 20 عينات في كوب 3.5 سم طبق بيتري وpirpirate العازلة الزائدة.

إصلاح الأنسجة في ملليلتر واحد من 4٪ شبهformaldehyde لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة قبل غسل العينات بعناية ثلاث مرات لمدة دقيقتين في ملليلتر واحد من TBS الطازجة في الغسيل. بعد الغسيل الأخير، Permeabilize عينات مع ملليلتر واحد من 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة قبل غسل ثلاث مرات كما أظهرت فقط مع ملليلتر واحد من TBST في غسل. بعد الغسيل الأخير، كتلة أي ربط غير محددة مع ملليلتر واحد من 1٪ البوم مصل البقر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة تليها ثلاثة يغسل في TBST كما هو موضح.

بعد الغسيل الأخير، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، قم بغسل العينات ثلاث مرات باستخدام TBST قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل midguts ثلاث مرات ونقل العينات إلى شريحة المجهر نظيفة.

إزالة أكبر قدر ممكن من العازلة وصمة عار النوى مع قطرة واحدة من DAPI قبل تركيب مع غطاء وفحص الأنسجة المسماة عن طريق المجهر confocal. بالنسبة لتكميم TYLCV ، قم بغسل عينات أنسجة الفلعة البيضاء المقطوعة مرتين إلى ثلاث مرات في PBS جديدة ونقل 20 midguts ، 20 PSGs ، أو مبيض واحد في خمسة ميكرولترات من PBS إلى أنابيب PCR الفردية التي تحتوي على 25 ميكرولترات من محلول التحلل. إضافة خمسة إلى سبعة اثنين من الخرز السيراميك ملليمتر قطرها إلى كل أنبوب وطحن العينات في التجانس.

إضافة عينة واحدة ثمانية ميكرولتر من الهيموليتف في أنبوب PCR جديد وإضافة 10 ميكرولترات من التحلل إلى الأنبوب مع خلط شامل. احتضان جميع العينات في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تليها حضانة لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية وطرد المركزية وجيزة. بعد ذلك، أضف 18 ميكرولترات من المزيج الرئيسي في قوارير أنابيب قطاع PCR الكمية وإضافة اثنين من ميكرولترات من كل عينة الحمض النووي إلى ثلاث قوارير على الأقل.

عندما يتم تحميل جميع العينات، أغلق الأنابيب والطرد المركزي إلى الرواسب الحل في الجزء السفلي من كل قارورة. تحميل قارورة على دورة الحرارية في الوقت الحقيقي لPCR الكمية، واختيار الانترنت وصبغة الفلوروفور وغير معروف كنوع العينة. ثم تصدير البيانات الكمية إلى جدول بيانات لتحليل الكمية النسبية من الحمض النووي الفيروسي في كل عينة.

هنا، يتم عرض صور تمثيلية من TYLCV في DAPI تلطيخ في PSGs اللافرف الأبيض، midguts، والمبايض. كما لوحظ، TVLCV يدل على تراكم أكبر داخل PSGs و midguts مما كانت عليه في المبيضين. يشير القياس الكمي للفيروس في PSGs، منتصف السجائر، الهيملmph، والمبايض بعد التغذية على الطماطم المصابة TYLCV لمدة 24 و 48 و 72 ساعة إلى أن كمية الفيروس تزيد في أنسجةرفيل بيضاء مختلفة في ارتباط مباشر مع الزيادة في فترة الوصول إلى الاكتساب.

فمن الأفضل لاستخدام الذباب الأبيض الطازج ، والحشرات الميتة سوف تزيد من صعوبة تشريح. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليلات أخرى، مثل النشاف الغربي والمشارك في المناعة، للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير البروتين الفيروسي والتفاعلات الفيروسية والبروتين المتجه.