تأثير تركيبات المسيل للدموع الاصطناعية على النشاط الأيضي للخلايا الظهارية القرنية البشرية بعد التعرض للديسيكيشن

الغرض من هذا البروتوكول هو تقييم نموذج المختبر ما إذا كانت تركيبات الدموع الاصطناعية يمكن أن تحمي الخلايا الظهارية للقرنية البشرية من الجفاف. يمكن استخدام هذه الطريقة للمساعدة في تحديد تركيبات جفاف العين التي يمكن أن تساعد في حماية العين للأفراد الذين يعانون من أعراض جفاف العين. يستخدم هذا الاختبار مقياسا حساسا للغاية للكشف عن نشاط التمثيل الغذائي للخلايا الظهارية في القرنية.

نتيجة لذلك ، يمكن اكتشاف تغييرات طفيفة في صحة خلايا القرنية بسبب الجفاف. ستظهر الإجراء اليوم باريسا ميرزابور ونيجاني ناجارودكوماران وأديلين سوكو. ابدأ بزراعة الخلايا الظهارية للقرنية البشرية الخالدة في قوارير مغلفة بالكولاجين مع 20 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ مصل بقري للجنين و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، وتغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بمجرد أن تكاد تكون الخلايا ملتقية ، قم بإزالة وسائط زراعة الخلية ، وأضف أربعة إلى ستة ملليلتر من وسائط تفكك الخلايا إلى كل قارورة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل ، وفحصها بشكل دوري تحت المجهر. أضف ملليلترين إلى ستة ملليلترات من DMEM / F12 مع 10٪ FBS إلى كل قارورة ، وانقل المحتويات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا.

الطرد المركزي للخلايا عند 450 إلى 500 مرة جم لمدة خمس دقائق. ثم استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في وسائط دافئة مسبقا. حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم ، واحسب الحجم الذي يحتوي على 100 ، 000 خلية.

أضف وسائط إلى كل بئر من لوحة الثقافة المطلية بالكولاجين I المكونة من 48 بئرا ، جنبا إلى جنب مع الحجم المحسوب للخلايا ، مع التأكد من أن الحجم النهائي في كل بئر هو 0.5 ملليلتر. ثم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. بالنسبة لإجراء التحكم ، قم بإزالة وسائط الثقافة من الآبار ، وعالج الخلايا على الفور ب 150 ميكرولتر من تركيبة الاختبار أو محلول التحكم في الوسائط.

ثم احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة محلول الاختبار من الخلايا ، وأضف 0.5 مل من محلول صبغة التمثيل الغذائي بنسبة 10٪. احتضان الخلايا لمدة أربع ساعات أخرى.

بعد الحضانة ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من محلول الصبغة من كل بئر ، وانقله إلى لوح 96 بئر. استخدم قارئ الألواح لقياس تألق كل بئر ، واضبط الإثارة على 540 نانومتر والانبعاث على 590 نانومتر. لتنفيذ إجراء الاسترداد ، احتضان الخلايا بمحاليل الاختبار أو عناصر التحكم كما هو موضح سابقا.

ثم أضف 0.5 مل من وسائط DMEM / F12 إلى كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة. ثم قم بإزالة الوسائط واختبر نشاط التمثيل الغذائي.

لتنفيذ إجراء التحكم ، قم بإزالة وسائط الثقافة من الخلايا الموجودة في اللوحة المكونة من 48 بئرا ، وقم بمعالجتها على الفور بتركيبة الاختبار أو محلول التحكم في الوسائط. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محاليل الاختبار من الخلايا ، وضعها في غرفة رطوبة 37 درجة مئوية و 45٪ لمدة خمس دقائق حتى تجف.

بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من محلول صبغة التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ ، واحتضن الخلايا لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، انقل 100 ميكرولتر من محلول الصبغة الأيضية من كل بئر إلى لوح 96 بئرا ، وقم بقياس التألق. لتنفيذ إجراء الاسترداد ، كرر البروتوكول الموصوف سابقا ، وقم بتضمين حضانة لمدة 18 ساعة مع وسط DMEM / F12 بعد خطوة التجفيف.

ثم قم بإجراء تحليل إحصائي على البيانات كما هو موضح في المخطوطة النصية. تمت مقارنة ثلاث تركيبات للعين الجافة لتأثيرها على صلاحية الخلايا الظهارية للقرنية البشرية. كان للمحللين الأول والثاني تأثير كبير على النشاط الأيضي للخلايا قبل الجفاف.

أظهرت الخلايا المعرضة للمحلول الأول انخفاضا إضافيا في نشاط التمثيل الغذائي للخلايا بعد 18 ساعة من التعافي ، مما يعني أنها أصيبت في البداية ولم يتم إصلاح الإصابة. بالمقارنة ، كان للمحلول الثالث تأثير خفيف فقط على النشاط الأيضي للخلايا الظهارية. عند مقارنة قدرة تركيبات العين الجافة المحتوية على الدهون على حماية الخلايا ، وجد أن المحلولين الأول والثاني لا يحميان الخلايا من إجهاد الجفاف.

ومع ذلك ، فإن الحل الثالث يوفر بعض الحماية. عند زرع الخلايا في صفائح مغلفة بالكولاجين ، تأكد من أن معلق الخلية يحتوي على خلايا مختلطة بشكل موحد بحيث يتم زرع كل بئر بأعداد خلايا متساوية. أظهر الحل الثالث تحسنا معتدا به إحصائيا في بقاء الخلية والحماية من إجهاد الجفاف مقارنة بالمنتجين الآخرين المحتويين على الدهون.

من الممكن أن يسمح الزيت المعدني الذي يحتوي على الدهون الفوسفورية ، جنبا إلى جنب مع HP-guar والبروبيلين جلايكول ، للمحلول الثالث بتوفير حماية الترطيب لخلايا القرنية وتقليل التبخر تحت الجفاف.