محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

محلل البنية الفرعية هو سير عمل سهل الاستخدام يقوم بإجراء تحليل تلقائي لمقاييس المجهر متعددة العمليات. وهذا لا يعني صفر طن من البرمجيات المفتوحة المصدر الجليدية وأيضا باستخدام وظائف الجهاز. الأهم من ذلك، هذا العمل هو منتجع بأسعار معقولة إنتاج المعرفة وتحليل الصور.

يتم تحميل صور متعددة القنوات داخل سير العمل ومعالجتها مسبقا من أجل تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وإزالة التصوير أو العيوب. ثم، يعزل تجزئة الصورة المناطق ذات الاهتمام، والمعروفة أيضا باسم ROIs من الخلفية. تتوفر عدة طرق للتجزئة حسب مستوى التجميع وطبيعة الكائنات ذات الأهمية.

يتم حفظ الكائنات المجزأة باستخدام واصف معين في مجلد معين. ثم يتم تحليل القوة والإشارات داخل الصفوف وميزات متعددة مثل الموقع والحجم والشكل في القوام الكثافة ولكن يتم تصدير العدد والحجم إلى جدول بيانات يتم إنشاؤه تلقائيًا. تحميل الجليدية من موقع على شبكة الإنترنت الجليدية.

ثم تحميل بروتوكول محلل الهيكل الفرعي من مكتبة الجليدية للبروتوكولات. افتح Icy، وانقر على الأدوات الموجودة في قائمة الشريط. انقر على البروتوكولات لفتح واجهة محرر البروتوكولات.

انقر فوق تحميل وفتح محلل الهيكل الفرعي البروتوكول. يمكن أن يستغرق تحميل البروتوكول بضع ثوانٍ. يتكون سير العمل من 13 كتلة عامة تعمل كل كتلة كـ خط أنابيب يتكون من عدة مربعات تؤدي مهام فرعية معينة.

يتم ترقيم كل كتلة أو مربع، ويكون له رتبة معينة ضمن سير العمل. بالنقر فوق هذا الرقم، قم بتعيين أقرب موضع ممكن إلى الأول إلى الكتلة المحددة. يتم إعادة تنظيم مواقع الكتل الأخرى.

بالنقر على أيقونة الزاوية اليسرى العليا، يمكن طي الكتلة. ويمكن أيضا أن تكون الموسعة، وتضييق أو إزالتها. كل خط أنابيب سير العمل هو نشأت الصحيح من قبل شبكة من مربعات متصلة معا من قبل المدخلات والمخرجات الأخرى.

لإنشاء اتصال، انقر فوق إخراج والاحتفاظ بها حتى يتعلق المؤشر بأي إدخال. يمكن إزالة الاتصالات بالنقر على علامة الإخراج. إذا لزم الأمر إعادة تسمية الملفات بحيث تسلسل إلى أن يتم دمجها، يكون نفس بادئة الأسماء متبوعة فاصل مميزة.

على سبيل المثال، يتم تسمية تسلسلات القنوات الفردية من صورة A الصورة بالأحمر سفلية و الصورة أ سفلية زرقاء وهكذا. في نفس المجلد، قم بإنشاء مجلد جديد لكل قناة لدمج. على سبيل المثال، لدمج القنوات الحمراء والأخضرة والزرقاء، قم بإنشاء ثلاثة مجلدات وتخزين التسلسلات المطابقة داخل هذه المجلدات.

استخدم قنوات دمج الكتلة فقط، وإزالة الكتل الأخرى وحفظ البروتوكول كقنوات دمج. الوصول إلى المربعات من أجل تعيين المعلمات. في المربع، رقم القناة x، اختر القناة التي تريد استخراجها.

في صور RGB الكلاسيكية ، الصفر أحمر ، واحد أخضر واثنين من اللون الأزرق. في المربع، رقم قناة المجلد x، مائل للخلف اسم المجلد الذي يحتوي على صور للقناة x. في المربع، رقم قناة منفصل x.

استخدام الفاصل لاسم الصورة. في المربع، لون خريطة قناة رقم x، تشير مع عدد أي عمود من النموذج لاستخدامها لتصور القناة المقابلة في الجليدية. في المربع، تنسيق الصور المدمجة، اكتب الملحق لحفظ الصور المدمجة.

في الزاوية اليسرى العليا من كتلة قنوات الدمج، انقر على الرابط مباشرة إلى يمين المجلد. في مربع الحوار المفتوح الذي يظهر، انقر نقراً مزدوجاً فوق المجلد الذي يحتوي على تسلسلات القناة الأولى التي تم تعريفها في مربع المجلد قناة رقم واحد. ثم انقر على فتح، ركض البروتوكول.

يتم حفظ الصور المدمجة في مجلد مدمج في نفس الدليل كمجلدات القنوات الفردية. تجزئة الكائن، هي الخطوة الأكثر تحديا في تحليل الصور. انها كفاءة يحدد دقة القياسات مجموعة الناتجة.

لذا ، محلل هيكل يدمج كل من الخوارزميات بسيطة وأكثر تعقيدا لاقتراح بدائل مختلفة تتكيف مع تعقيد الصورة واحتياجات المستخدم. إذا لم تلمس الكائنات بعضها البعض، لا يحتاج المستخدم الآخر إلى تمييز الكائنات متفاوتة المسافات بشكل فردي استخدام تجزئة كتلة A.When الكائنات لا تلمس بعضها البعض، ولكن بعضها على مقربة، واستخدام كتلة B.for الكائنات مع مستوى التجمع العالي وشكل محدب، استخدم كتلة تجزئة الكائنات C.If تقديم مستوى التجمع عالية ولها أشكال غير منتظمة ، استخدم تجزئة الكتلة D.Use تجزئة الكتلة في مجموعات السيتوبلازم لتجزئة السيتوبلازم بشكل فردي باستخدام النوى المجزأة كعلامات. يمكن أن تتم عملية منع التكييف لتجزئة الكائن الأساسي بشكل مستقل بحيث يمكن استخدام عدة كتل في نفس التشغيل لمقارنة كفاءتها لبنية فرعية معينة أو إلى تقسيم أنواع مختلفة من الهياكل الفرعية.

لتوضيح تجزئة، تم اختيار تجزئة كتلة B، التي تناسب عدد أكبر من القضايا. لاستخدام هذا بلوق. أولاً، قم بربطه لتحديد المجلد.

ثم استدعاء إشارة قناة تعيين قناة الكائن إلى مقطع. على سبيل المثال، لتتوافق مع B، في المربع HK يعني، تعيين المعلمة فئات الكثافة والحد الأدنى التقريبي والحد الأقصى للأحجام في بكسل الكائنات التي سيتم الكشف عنها. بالنسبة لفئات الكثافة، ستصنف قيمة اثنين وحدات البكسل في فئتين، الخلفية والمقدمة.

وهكذا يتم تكييفها عندما يكون التباين بين الكائنات والخلفية عالية. إذا كان الكائنات الأمامية لها شدة أصولها أو التباين مع الخلفية منخفضة، قم بزيادة عدد الفئات. في الإطار ملامح نشطة تحسين الكشف عن حدود الكائنات.

أثناء العملية، سيتم إنشاء مجلد لحفظ صور الكائنات المجزأة. في نص مربع، اسم هذا المجلد، على سبيل المثال، تجزئة النوى. لتعيين تنسيق لحفظ صور الكائنات المجزأة، قم بتعبئة تنسيق مربع صور الكائنات المجزأة، تشغيل البروتوكول.

يتم إنشاء المجلد في المجلد الذي يحتوي على الصور المدمجة. وقد تم تطوير كتل مختلفة للتكيف مع عدد من القوانين والقنوات وحجرات الخلية ليتم تحليلها في الكائنات مجزأة. في المثال التالي، للتحليل، اختر القنوات تحليل الفلوريسينت كتلة P.Two في نفس المقصورة وربطه لتحديد المجلد.

يجب أن يكون قد تمت معالجة كتلة التجزئة قبل هذا التحليل تعيين المعلمات علبة الوارد مجلد الصور ROI ، كتابة اسم المجلد الذي يحتوي على صور الكائنات المجزأة مسبوقة مائلة. تنسيق علبة الوارد من الصور من الكائنات المجزأة ، وكتابة تنسيق المستخدمة لحفظ الصور من الكائنات المجزأة. علبة الوارد قتل الحدود لإزالة كلا الكائنين.

خلاف ذلك ، في الوقت الحالي ، مطلوب تركيب مجموعة أكثر من التصوير J بالكامل لاستخدام هذه الوظيفة. في مربعات قناة إشارة النقطة، تعيين القناة حيث يجب الكشف عن البقع. في الصور RTP الكلاسيكية، صفر هو الأحمر واحد هو الأخضر واثنين هو الأزرق.

في خانات اسم جزيء مترجمة، اكتب اسم جزيء المترجمة في البقع. عدد الحقول للرد يعتمد على عدد من الجزيئات. في أطوال موجية لكل كتلة كاشف، قم بتعيين معلمات الكشف عن البقع لكل قناة على حدة.

من أجل معالجة كتل مختلفة في غرفة، والحفاظ على اتصالات من القطع المختارة، مع مجلد تحديد كتلة. تأكد من أن رتبهم تحت المعالجة الجيدة لسير العمل. قبل تشغيل سير العمل، من المستحسن أيضاً إزالة الكتل غير المستخدمة وحفظ البروتوكول الجديد باسم آخر.

انقر على تشغيل لبدء سير العمل. عندما يفتح العين تبدو الكتب يظهر. انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد الذي يحتوي على الصور ممرضة ثم انقر على فتح، وسير العمل سيتم تشغيل تلقائيا.

إذا تم إكمال معالجة الرسالة، سير العمل المنفذة بنجاح سوف تظهر في الزاوية اليمنى السفلى، سيتم وضع علامة على كافة الكتل مع علامة خضراء. إذا لم يكن كتلة وداخل مربع تقديم علامة السهم سوف تشير إلى العناصر الصحيحة. الأهم من ذلك، عدة شاشات تسمح لتصور النتائج المتوسطة أثناء كل تشغيل من أجل التحكم في المعالجة.

وستقتصر سرعة سير العمل ومرونته ووظيفته على أمثلة مختلفة. في هذا المثال الأول، نحلل النقل النووي للمحاكاة NF kappa B.After مع تركيزات متزايدة من TNF ألفا. تم تحديد النوى والسيتوبلازم باستخدام كتل تجزئة C و E.

تم تحليل NF kappa B تزدهر في إشارة باستخدام كتلة تحليل النقل العالمي. تم تحليل أكثر من 40,000 خلية في 96 صورة في 26 دقيقة. واستخدمت البيانات المتولدة لتحديد منحنى استجابة الجرعة هذا الذي يبين تحريض NF Kappa B نقل النووية بواسطة TNF ألفا.

يمكن استخدام سير العمل أيضاً للكشف عن حجم الملف واستخراج معلومات محددة حول ميزاتها. هنا، تم الكشف عن خصائص في الخلايا الفردية عن طريق توطين EDC للبروتين. تم تحديد النوى في السيتوبلازم باستخدام كتل تجزئة A و E.

تم تحليل EDC4 باستخدام كتل تحليل الفلوريسنس C.In هذا المثال ، تم الكشف عن علامة EDC4 CYtoplasmic في كل من الخلايا التي تم تحليلها. يتم إعطاء حجم كل جانب كامل بالبكسل في جدول البيانات. في هذا المثال، أخذنا الاستفادة من براعة سير العمل لدراسة الكربوهيدرات حركية أطول من الإجهاد التأكيدي.

علامة القوة النووية من اللوين هي المكونات الهيكلية الرئيسية للكربوهيدرات تم تحليل عددهم وحجمهم وفقا لحجم, حالة الإجهاد, تقييمها من قبل فواصل حبلا مزدوجة المترجمة مع 53BP1. تم تحديد Nuclei باستخدام وكيل التجزئة والقوة النووية وإشارات الملف و53BP1 ، تم تحليلها في وقت واحد باستخدام تحليل الفلوريسنس بلوك B.Using بيانات من 2300 خلية فردية ، ونحن أظهرنا زيادة كبيرة في عدد موقع غرينفيلد بعد تحريض الإجهاد المرتبطة بانخفاض في حجمها. هذه البيانات تشير بقوة إلى أن الإجهاد التأسدي يغير قوة نوية الكربوهيدرات في استخدام توزيع نووي في عدد من النووية الأصغر للموقع لتبرير تغيير في التعبير اللوين يمكن أن يغير توطينه وتغيير نوى الهيئات المنحنى.

وكان فرط التعبير عن بروتين الانصهار GFP الانصهار exged. تم تحليل ملامح أجسادنا وفقا لGFP ملفين overexpression مستوى. تم تحديد Nuclei باستخدام كتلة التجزئة A.The الإشارات الفلورية من اللفائف ولفائف GFP ، تم تحليلها في وقت واحد باستخدام كتلة تحليل الفلوريسنس B.The وينعكس مستوى فرط التعبير من ملف GFP من خلال كثافة معنى إشارة GFP في النوى الفردية.

تظهر البيانات الناتجة عن محلل البنية الفرعية أن ملف GFP في التعبير الزائد يزيد بشكل كبير من حجم وعدد الكربوهيدرات. منذ الإجهاد التأاكسى يزيد من عدد الكربوهيدرات ولكن يقلل من حجمها. قد تعكس هذه البيانات أن تأثير الإجهاد التأسدي على بنية الكربوهيدرات هو الأكثر إثارة على الأرجح عن طريق تغيير تكوينها بدلاً من تأثير على كمية معينة من اللفائف.

لذلك هيكل محلل هو سير العمل وحدات للغاية لتحليل الصور الحيوية. ويمكن تكييفها مع سياقات عدة من دمج القنوات البسيطة إلى القياس الكمي لطوابق متعددة وإشارات في آلاف الخلايا. كما أنه يدمج خوارزميات التجزئة البسيطة والمعقدة اعتمادًا على تعقيد الصورة ويُتمكّن من استخراج ميزات الإشارة الفلورية.