القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

يرتبط الكينورينين بتنظيم الاستجابة المناعية في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان. تساعد الطرق الموثوقة والمعتمدة لتحديد الكينورينين المتعدد في تطوير علاجات أكثر فعالية. يستخدم بروتوكولنا الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي لتحديد مستقلبات التربتوفان المختلفة الناتجة عن مسار الكينورينين في وسط تم جمعه من مزارع الخلايا السرطانية.

قد يواجه المستخدمون عديمي الخبرة بعض الصعوبة أثناء خطوات إعداد العينة أو الحصول على البيانات وتفسيرها. باتباع بروتوكولنا وتوصياتنا ، يمكن للمرء تجنب الأخطاء والحصول على بيانات موثوقة. لتحضير محاليل مخزون الكواشف ، قم بوزن 0.3 ملليغرام من كل كاشف في قارورة بأعلى دقة وقم بإذابة كل كاشف في 300 ميكرولتر من المذيب المناسب للحصول على جرام واحد لكل لتر من محاليل المخزون لكل كاشف.

لتحضير وسط الاستزراع المعالج بالفحم ، قم بوزن 280 ملليغرام من الفحم المنشط في أنبوب مخروطي الشكل وأضف خمسة ملليلتر من الوسط السائل المحضر لزراعة الخلايا ذات الأهمية. هز الأنبوب بالوسط والفحم على أرجوحة أرجوحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة و 50 تذبذبا في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بترسيب الفحم عن طريق الطرد المركزي وجمع المادة الطافية بعناية دون إزعاج الفحم ، ثم قم بتصفية الوسط باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر.

لتحضير محلول المعايرة ، قم برفع وسط الاستزراع المعالج بالفحم ب 0.75 ميكرولتر من محلول 3NT لكل لتر وأضف 3-H kynurenine و 3-HAA kynurenine وحمض الزانثورينيك إلى ستة تركيزات مختلفة على الأقل لتغطية جميع نطاقات المعايرة إلى حجم نهائي يبلغ 150 ميكرولتر لكل عينة. بعد الدوامة ، أضف 150 ميكرولتر من الميثانول البارد تحت الصفر 20 درجة مئوية مع حمض الفورميك 1٪ إلى كل أنبوب لإزالة البروتين من العينة وغطاء الأنابيب بإحكام ودوامة مرة أخرى. بعد حضانة لمدة 40 دقيقة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر، قم بالطرد المركزي للعينات واستخدم ماصة أوتوماتيكية لنقل 270 ميكرولترا من كل مادة طافية إلى قوارير زجاجية فردية مسطحة القاع.

ضع القوارير في مبخر واستخدم البرنامج المناسب لكسور الميثانول المائي لتبخير المكونات المتطايرة برفق لمدة 30 دقيقة تقريبا. عندما تجف الأنابيب ، أعد تكوين كل عينة في 60 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في الماء وقم بدوامة العينات قبل نقل كل محلول إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مليلتر للطرد المركزي. دون إزعاج الرواسب ، انقل المواد الطافية إلى قوارير كروماتوغرافية مع إدخالات زجاجية مخروطية وضع القوارير في جهاز أخذ العينات التلقائي LC-MS.

قبل تشغيل العينات ، قم بتطهير نظام LC بالمرحلة المتنقلة لإزالة الفقاعات وتجهيز جميع قنوات المذيبات. بعد ذلك ، قم بغسل الحارس والعمود التحليلي باستخدام الأسيتونيتريل بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل شطف النظام بمذيب 100٪ A حتى يتم ملاحظة ضغط مستقر في العمود ، ثم قم بتعيين معلمات LC المناسبة في برنامج الحصول على البيانات وقم بإنشاء قائمة عمل لتشغيل العينات على نظام LC. لإنشاء منحنى المعايرة ، في برنامج الحصول على البيانات ، أضف معايير المعايرة إلى قائمة العمل وقم بتشغيل المعايير في ثلاث نسخ ، ثم قم بدمج وقياس منطقة الذروة المقابلة ل 3-hydroxykynurenine و kynurenine و 3-hydroxyanthranilic acid و 3-nitrotyrosine وحمض الزانثورينيك في وقت الاحتفاظ حوالي 4.4 و 10 و 16 و 21 و 30 دقيقة على التوالي.

لجمع عينات طافية من مزرعة الخلايا في المختبر ، بعد 48 ساعة من زراعة الخلايا القياسية للخلايا المعنية ، قم بنقل 500 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مليلتر وإزالة بقايا الخلية عن طريق الطرد المركزي ، ثم نقل المواد الطافية المتوسطة إلى أنابيب جديدة لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى التحليل والحفاظ على كريات الخلية عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل تقدير البروتين. لتحضير عينات لتحليل LC-MS ، قم بنقل 149.25 ميكرولتر من كل عينة وسط ثقافة مذابة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ميكرولتر وأضف 0.75 ميكرولتر من محلول 3NT 0.1 جرام لكل لتر إلى كل أنبوب. بعد تحضير العينات كما هو موضح ، أضف 150 ميكرولتر من الميثانول تحت الصفر 20 درجة مئوية مع حمض الفورميك 1٪ إلى كل أنبوب وقم بإعداد العينة لتحليل LC-MS كما هو موضح.

عند اكتمال قائمة العمل ، قم بقياس مساحة الذروة لكل مادة تحليلية واستخدم معادلة معايرة خطية فردية مخصصة لكل محلل لحساب تركيزات التحليلات الموجودة داخل كل عينة تجريبية. لتقييم محتوى البروتين الخلوي المقابل لعينة وسط الاستزراع ، أعد تعليق كل حبيبات خلية في 100 ميكرولتر من PBS وتجميد العينات عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة قبل إذابتها على الجليد. بعد تجميد العينات ثلاث مرات ، قم بجمع محللات الخلية عن طريق الطرد المركزي ونقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة دون إزعاج الكريات.

قم بتخفيف العينة 10 مرات باستخدام PBS الطازج وأضف الكميات المناسبة من محلول ألبومين مصل الأبقار القياسي في نسختين إلى الآبار المناسبة لصفيحة 96 بئرا. قم بتحميل 10 إلى 15 ميكرولترا من كل عينة محللة خلية طافية إلى الآبار المناسبة للوحة 96 بئرا واملأ كل من الآبار القياسية والعينة إلى الحجم النهائي البالغ 50 ميكرولتر من PBS لكل بئر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد المخفف خمس مرات بماء نقاء للغاية إلى كل بئر واحتضان اللوحة لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، قم بتحميل اللوحة على قارئ صفيحة دقيقة وقم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر ، ثم قم بإنشاء منحنى معايرة للسماح بحساب كمية البروتين في كل عينة وتقسيم تركيز كل كينورينين على إجمالي محتوى البروتين لتطبيع كمية الكينورنين في كل عينة لكل ميكروغرام واحد من البروتين. فيما يلي نتائج قياس الطيف الكتلي رباعي الأقطاب المفردة التي تم الحصول عليها أثناء تحليل الوسط الذي يحتوي على 4.5 جرام لكل لتر من D-glucose و 10٪ مصل بقري للجنين. لاحظ الذروة الصغيرة التي تشير إلى وجود الكينورينين داخل العينة.

قم بتشغيل عينة مراقبة الجودة قبل طلب بيانات العينة الفعلية لتأكيد أوقات الاحتفاظ المناسبة للتحليلات حيث يمكن ملاحظة التحول في إشارات LC أو عدم التطابق. يمكن لمكونات المصفوفة المشتركة أن تولد أيونات مع نسبة الشحن الرئيسية المحددة للتحليلات المستهدفة. على سبيل المثال ، في هذا التحليل ، ظهرت الذروة من المركب المجهول في فترة المسح التي تمت خلالها مراقبة أيون نسبة الشحنة الرئيسية 206.

نظرا لعدم توافق وقت الاستبقاء ، لم تتوافق الإشارة مع المادة التحليلية. على الرغم من أن نظير التربتوفان يشترك في نفس الأيون مثل نسبة الشحنة الرئيسية 206 ، إلا أن التحليل الكروماتوغرافي كشف أن إشارة التربتوفان كانت منفصلة جيدا عن إشارة حمض الزانثورينيك ، مما يشير إلى أن مستوى التربتوفان الموجود في وسط الخلية السرطانية المختبرة لم يؤثر على القياس الكمي لحمض الزانثورينيك. يوضح هذا التحليل لوسط الاستزراع من نوعين من خطوط الخلايا السرطانية أن خلايا سرطان الثدي الظهارية البشرية التي تم تقييمها أطلقت كميات مختلفة من مستقلبات التربتوفان بينما أنتجت خلايا سرطان المبيض البشرية المختبرة مستويات أعلى بكثير من الكينورينين.

يساعد استخدام معيار داخلي أثناء إعداد العينة في الحصول على بيانات موثوقة. يؤدي تطبيع البيانات إلى محتوى البروتين إلى تصحيح التغيرات في عدد الخلايا داخل الآبار الفردية. يمكن توسيع بروتوكولنا بشكل أكبر لتحديد تحليلات إضافية ، ولكن قد يتراكم في وسط الثقافة في ظل ظروف تجريبية مختلفة.