تقييم الأكسدة الخلوية باستخدام مقصورة فرعية خاصة ببروتين الفلورسنت الأخضر الحساس للأكسدة الحمراء

المقيّمون البروتوكول الحاليون في النسيج، تتغير حالة الأكسدة الحمراء بطريقة خاصة بالحجرة داخل الخلايا. بروتوكول لدينا تمكن من فهم أفضل ورصد جميع الآليات الفسيولوجية أو الفيزيولوجية من الإجهاد التأ المؤسد. تسمح هذه التقنية بالتدميم الكمي غير التخريبي لنسبة كبريتيد العين المبلط في الخلايا السليمة باستخدام مخرج قياسي نسبة لموازنة الاختلافات بين مستويات التعبير إشارة، تبييض الصور، والكشف عن الحساسيات.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الكائنات الحية المختلفة، بما في ذلك البكتيريا في النباتات. في اليوم الأول من التجربة علاج الخلايا من خط خلية سرطان الثدي التقاء لمدة دقيقتين، مع ملليلتر من 0.2، 5٪ رحلات في EDTA. عندما تبدأ الخلايا لفصل القبض على رد الفعل مع ستة ملليلتر من كامل المتوسطة والرواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من الطازجة, متوسطة كاملة, عد الخلايا وتمييع لهم إلى 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم البذور 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من الخلايا في بئر في لوحة 6 جيدا، واحتضان الخلايا في الحاضنة ثقافة الخلية بين عشية وضحاها. أو لا تضيف أي الصف الفيروسية GFP نقل.

في صباح اليوم التالي، إضافة 12.5، 25، و 50 ميكرولتر من واحد إلى 100 المخفف ست مرات 10 إلى تشكيل وحدات البلاك 10 لكل ملليلتر من إضافة أي فيروس تآكل حل GFP، في المتوسطة كاملة. إضافة إلى أن الآبار المناسبة أو 6 آبار لوحة لtransduce الخلايا مع 50 و 100 و 200 تعدد العدوى، على التوالي. عندما تم نقل كل من الآبار عينة مع الفيروس، والعودة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 16 إلى 24 ساعة.

في اليوم التالي، تصور الخلايا عن طريق المجهر الفلوريستين واستبدال نابيرنت مع المتوسطة، دون فيروس للسماح للخلايا لاسترداد لمدة 24 ساعة إضافية. لتحديد الكفاءة المثلى في عملية النقل، قم بتقييم كثافة الفلورس ومورفولوجيا الخلايا بواسطة عملية استئصال الخلايا المتدفقة. تأكد من إجراء جميع الإجراءات التي يمكن أن تسبب العدوى من الهباء الجوي أو البقع داخل مستوى السلامة البيولوجية اثنين من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية المعتمدة.

لتقييم حالة الأكسدة الحمراء للخلايا ، في صباح اليوم التالي ، احتضان الخلايا والآبار المناسبة من لوحة 6 بئر مع 10 بيروكسيد الهيدروجين ميكرومولار لمدة ساعة واحدة ، قبل فصل الخلايا مع 750 ميكرولترات من 0.2 ٪ التنقيط في EDTA في البئر ، كما ثبت. وقف التفاعل مع مليلترين من المتوسط الكامل في البئر وسحب supernatants لكل حالة في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الكريات في 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في البئر عن طريق الطرد المركزي مرتين.

بعد الغسيل الثاني، قم بتصفية تعليق الخلايا من خلال 40 مترًا صغيرًا في أنابيب متوافقة مع قياس الخلايا على الجليد، محمية من الضوء. في برنامج مقياس التدفق، قم بتشغيل التعدد الصفري لعينة التحكم في العدوى. ثم تحليل بيروكسيد الهيدروجين والخلايا غير المعالجة.

وسيتيح حساب متوسط نسبة كثافة الفلورسنت بين الأشكال المؤكدة مقابل الأشكال المخفضة للصف من أجل الانبعاثات الإجمالية، باستخدام الصيغة كما هو مبين. وهنا تظهر استراتيجية الغات لاختيار عدد كبير من الخلايا عن طريق تدفق cytometry. ويمكن أيضا أن تستخدم تدفق cytometry لتحديد منحنى استجابة الجرعة لتحليل GFP الصف والتعدد الأكثر كفاءة من مدخلات العدوى.

وفقا لتعدد العدوى، منحنى استجابة الجرعة في هذا التحليل التمثيلي، و 200 تعدد العدوى أعطى أعلى تعبير GFP الطريق، ولكن تم تنفيذ مورفولوجيا الخلية مما يوحي السمية الخلوية. ولذلك، تم تحديد كفاءة النقل الأمثل لتكون تعدد العدوى من 100. في هذا التحليل حالة الأكسدة، وأكسدة وانخفاض الصف GFP يعني تم الحصول على كثافة الفلوريسنس من تحليل تدفق قياس خلايا للمركبة وأربعة 10 ميكرومولار إيجابية التحكم في علاجات بيروكسيد الهيدروجين.

تمثل الرسوم البيانية المتراكبة التحولات في رقم الخلية في 10 ميكرومولار بيروكسيد الهيدروجين والمجموعات المعالجة مركبة أو انخفاض وأكسدة تآكل GFP. وحساب النسبة بين الصف المؤسد والمخفض GFP لهذا التحليل كشف أن 10 ميكرومولار بيروكسيد الهيدروجين تسبب في زيادة ثلاثة أضعاف في أكسدة الصف GFP مقارنة مع معالجة السيارة. وجود أرقام الخلايا دقيقة مهم لحسابات التصوير بالرنين المغناطيسي وإعادة إنتاج.

من أجل الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ ، يجب على الباحثين خلط الحلول المضادة للفيروسات بشكل شامل للحصول على تعليق متجانس. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بدراسة التغيرات السريعة في الأكسدة الحمراء كجزء لا يتجزأ من النطاق الواسع للعمليات الخلوية العادية وتطور المرض في الوقت الحقيقي.