قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous
مايو 22, 2020
هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.
يسمح الاختبار القائم على الخلية بمراقبة وقياس تفاعلات الالتصاق العابرة دون الحاجة إلى تنقية طويلة للبروتين أو معدات متخصصة. على الرغم من أن تفاعلات البروتين التي تم اختبارها هنا ذات صلة بعلم الأعصاب ، إلا أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مجال من مجالات البحث حيث يحدث التصاق البروتين بين الخلايا. بعد 48 ساعة من نقل خلايا HEK-293T ، قم بحصاد الخلايا من الصفيحة المكونة من ستة آبار للتجميع.
أولا ، اغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، لفصل الخلايا برفق ، أضف ملليلترا واحدا من 10 ملليمولار EDTA إلى كل بئر ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق من الحضانة ، اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا وحصاد كل بئر في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل.
الطرد المركزي الأنابيب عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أثناء تكوير الخلايا ، قم بإعداد ستة أنابيب حضانة عن طريق وضع العلامات على قمم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة بالظروف التجريبية. يجب استخدام كل تبديل من GFP و mCherry .
قم بإزالة المادة الطافية من الأنابيب المخروطية سعة 15 مليلتر وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المتوسط. باستخدام مقياس كثافة الدم ، عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي. ثم قم بنقل 200 ، 000 خلية من كل حالة إلى أنبوب الحضانة المناسب لمزيج واحد لواحد بحجم إجمالي يبلغ 500 ميكرولتر.
بعد تقييم التجميع الأساسي الموصوف في القسم التالي ، ضع أنابيب الحضانة في دوار أنبوب بطيء في درجة حرارة الغرفة. لتقييم التجميع ، عند خط الأساس ومرة أخرى بعد 60 دقيقة ، قم بإدخال 40 ميكرولتر من أنبوب الحضانة على شريحة مجهر مشحونة. يجب أن يتم اكتساب خط الأساس في أسرع وقت ممكن بعد إضافة الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
قم بتصوير الشريحة تحت التألق في كل من القناتين الخضراء والحمراء. لكل شريحة، التقط صورا لثلاثة مجالات رؤية مختلفة في مستوى بؤري واحد. تم نقل خلايا HEK-293T ببروتين مثير للاهتمام ، أو بروتين متحور ذي أهمية ، أو رابط ذي أهمية وشاركت مع بروتين فلورسنت.
تم خلط مجموعات الخلايا التي تعبر عن البروتين محل الاهتمام مع مجموعات الخلايا التي تعبر عن الترابط محل الاهتمام وتقييمها للتجميع بعد 60 دقيقة. في تراكبات الصور الملتقطة في القناتين الخضراء والحمراء ، يظهر التجميع على شكل نقطة صفراء. أظهرت الظروف التي لم تعبر فيها الخلايا عن أي روابط متشابكة الحد الأدنى من التجميع.
أيضا ، تم عرض الحد الأدنى من التجميع عندما كان واحد فقط من المجموعتين يعبر عن روابط متشابكة. لم يظهر أي تجميع عندما عبرت مجموعتان من الخلايا عن جزيئات التصاق غير متوافقة. أظهرت الظروف ذات جزيئات الالتصاق المتوافقة تراكما كبيرا بعد حضانة لمدة 60 دقيقة.
والمثير للدهشة أن البروتين المتحور المعني أظهر تجميعا أكبر بكثير من نظيره من النوع البري ، مما يشير إلى أن الطفرة النقطية تعزز قدرات ربط البروتينات. ترتبط الطفرات في العديد من جزيئات الالتصاق عادة باضطرابات النمو العصبي والعصبي والنفسي والإدمان. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للمرء فحص آثار الطفرات النقطية ذات الصلة بالمرض على التفاعلات المتحولة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً محسناً للقياس السريع وشبه الكمي لتفاعلات الربيطة والمستقبل في وضع trans، باستخدام منهجية المجهر الفلوري في خلايا HEK-293T. تسمح هذه الطريقة بتكميم تفاعلات التصاق البروتين ذات الصلة بالبيولوجيا العصبية ومجالات بحثية أخرى محتملة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأحياء العصبي
- التصاق الخلايا
- التفاعلات البروتينية
خلفية علمية
- تُعد التفاعلات بين الربيطة والمستقبل بالغة الأهمية للتواصل الخلوي.
- يساعد فهم هذه التفاعلات في توضيح آليات الاضطرابات العصبية النمائية والنفسية العصبية.
- قد تتطلب الطرق التقليدية تنقية واسعة النطاق للبروتينات أو معدات متخصصة.
- تقترح هذه الدراسة نهجاً أكثر كفاءة باستخدام المجهر الفلوري.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول سريع وفعال لدراسة التصاق البروتين في مقايسة قائمة على الخلايا.
- تقييم كيفية تأثير الطفرات النقطية في البروتينات على التفاعلات عبر الخلوية (trans interactions).
- تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع في دراسات التصاق البروتين خارج نطاق علم الأحياء العصبي.
الطرق المستخدمة
- استُخدم المجهر الفلوري لتصوير التفاعلات الخلوية.
- استُخدمت خلايا HEK-293T كنموذج بيولوجي، مع التركيز على البروتينات والربيطات المنقولة.
- تضمن الجدول الزمني التجريبي تقييم تكتل الخلايا بعد 60 دقيقة من عملية النقل.
- أُجري عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، متبوعاً بإعادة تعليق الخلايا وخلطها لغرض التصوير.
النتائج الرئيسية
- تعزز تجميع الخلايا التي تعبر عن جزيئات التصاق متوافقة بشكل ملحوظ بعد 60 دقيقة.
- أظهرت البروتينات المتحورة تجميعاً أكبر مقارنة بنظيراتها من النوع البري، مما يشير إلى تحسن في قدرات الارتباط.
- لوحظ تجميع أدنى عندما لم تعبر أي من المجموعات الخلوية عن الربيطات المشبكية، أو عندما عبرت مجموعة واحدة فقط عنها.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة طريقة مبسطة لتقييم تفاعلات الالتصاق بين الخلايا.
- تسلط النتائج الضوء على إمكانية استخدام هذه التقنية في استكشاف تأثيرات الطفرات على تفاعلات البروتينات.
- تعد الرؤى المستمدة من هذه الطريقة قيمة لفهم الآليات الكامنة وراء مختلف الاضطرابات النفسية والنمائية العصبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا المقايسة القياس المباشر للتفاعلات البروتينية-البروتينية من النوع trans في سياق خلوي، مما يعالج قصوراً رئيسياً في المقايسات الكيميائية الحيوية التي لا يمكنها التمييز بين الارتباط من النوع cis والارتباط من النوع trans. ومن خلال قياس الالتصاق بين الخلايا ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية فقط، تعمل هذه الطريقة على تعزيز الثقة في التحقق من الأهداف وتقليل النتائج الإيجابية الكاذبة في مراحل الاكتشاف المبكرة. كما أنها تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية لأهداف الالتصاق المتورطة في الاضطرابات العصبية النمائية والنفسية العصبية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس الالتصاق عبر-الخلوي الوظيفي بين أزواج الربيطة والمستقبل التي يتم التعبير عنها في خلايا منفصلة.
- القيمة التشغيلية: يلغي الحاجة إلى تنقية البروتين، مما يتيح الفحص السريع للطفرات أو المتغيرات مباشرة في نظام خلوي.
- القيمة التنبؤية: يوضح التجمع المعزز مع طفرة مرتبطة بمرض كيف يمكن للمقايسة تحديد المتغيرات ذات اكتساب الوظيفة بغرض تحديد الأولويات.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تستخدم خلايا HEK الموسومة بفلوروفور لتوليد قراءات تصويرية قابلة للقياس الكمي (مثل النقاط الصفراء في الصور المتراكبة) من أجل تطويعها لعمليات الفرز عالية المحتوى.
- إمكانية التكرار: تتيح ظروف خلط الخلايا والحضن الموحدة إجراء قياسات متسقة للتجمع عبر التجارب المختلفة.
- قابلية التوسع: يدعم البروتوكول اختبار ظروف متعددة (مثل النوع البري مقابل الطافر، أو تركيبات الربيطات) بالتوازي باستخدام خطوات بسيطة من الخلط والتصوير.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- الأهمية المرضية: يختبر بشكل مباشر كيف تؤثر الطفرات النقطية في جزيئات الالتصاق — الشائعة في اضطرابات النمو العصبي، والاضطرابات النفسية العصبية، واضطرابات الإدمان — على التفاعلات عبر الخلوية (trans interactions).
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين فحوصات الارتباط المختبرية والأنماط الظاهرية الخلوية، مما يدعم اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف بناءً على بيانات الالتصاق الوظيفية.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يحدد ما إذا كانت الطفرات تعزز أو تعطل الارتباط بين الخلايا، مما يساهم في تحديد آلية الهدف وتوصيف السلامة.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يأتي هذا المقايسة في المرحلة ما بين فحص الارتباط بالهدف والتحقق الوظيفي، حيث توفر بيانات محددة حول الالتصاق لتوجيه عملية تحسين المركبات الرائدة واختيار المرشحات قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يختبر ما إذا كانت المتغيرات الجينية تغير الالتصاق بين الخلايا، مما يدعم توضيح المسارات والتحقق من صحة فرضيات الأهداف.
- التحليلات: يولد قراءات كمية قائمة على التصوير (تكون التجمعات بمرور الوقت) لمقارنة الظروف وتقييم قوة التفاعل.
- الأبحاث الانتقالية: يربط التغيرات الجزيئية بالأنماط الظاهرية الخلوية ذات الصلة بتكوين المشابك العصبية والاتصال العصبي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: قابل للتكيف مع أي نظام التصاق بروتيني بين الخلايا، مما يجعله منصة قابلة لإعادة الاستخدام عبر المجالات العلاجية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقيس التفاعلات العابرة (trans interactions) فقط، مما يقلل من التقدير المفرط للارتباط الملاحظ في المقاييس القائمة على المستخلصات الخلوية، ويعزز من خصوصية الهدف.
- القيمة التشغيلية: يستخدم طرق زراعة الخلايا القياسية والمجهر الفلوري، ولا يتطلب معدات متخصصة أو كواشف معقدة.
- القيمة الاستراتيجية: يتيح التقييم السريع لتأثيرات الطفرات على وظيفة الهدف، مما يدعم اتخاذ قرارات أدق بشأن المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) في مرحلة تحديد المركبات الرائدة.
- التأثير على المحفظة: يدعم ترتيب الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال تحديد المتغيرات ذات الالتصاق المتغير التي قد تؤثر على الفعالية أو السمية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في ترانسفكشن الخلايا الثديية، ووسم البروتينات الفلورية، وقياس التدفق الخلوي أو عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).
- يعتمد على المجهر الفلوري بقدرة تصوير ثنائية القنوات (مثل GFP و mCherry) وأدوات تحليل الصور لقياس التجمعات كمياً.
- يحتاج إلى توحيد مستويات تعبير الخلايا ونسب الخلط لضمان الحصول على قراءات تجميع قابلة للتكرار بين الفرق البحثية.
- قد يتطلب التكيف مع أنظمة غير HEK تحسين كفاءة الترانسفكشن والتعبير السطحي لجزيئات الالتصاق.
- يقتصر على تقييم الالتصاق؛ ولا يقدم تقارير عن إشارات نقل الإشارة اللاحقة أو أحداث الإدخال الخلوي التي تلي عملية الارتباط.
