نموذج لتولد الصرع في رينال القشرة-قرن آمون ثقافات شريحة العضوية

الصرع هو مرض عصبي سائد. تصور شرائح الفص القشرة الحصين العضية Rhinal cortex-hippocampus الأحداث المتطورة الشبيهة بالصرع التي تشبه الصرع الحي ويمكن بالتالي استخدامها كنموذج حي سابق لتولد الصرع. هذا النظام هو في الواقع أداة ممتازة لرصد ديناميات وتطور الصرع ، وكذلك لفحص الأهداف العلاجية المحتملة لهذا المرض الدماغ.

إظهار الإجراءات معي سيكون طلابي فرانسيسكو ميدا ومافالدا كارفالو. لحصاد الدماغ من يوم ما بعد الولادة ستة إلى سبعة الجرو سبراغ دولي، غسل الرأس أولا ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من GBSS. العمل في خزانة السلامة الحيوية، إدراج ملقط حاد بحزم في مآخذ العين لعقد الرأس في مكان واستخدام مقص تلميح رقيقة لقطع فروة الرأس على طول خط الوسط من الفوام الفقرية إلى الفصوص الأمامية.

قطع الجمجمة بنفس الطريقة وعلى طول الشق العرضي الدماغي واستخدام ملقط طويل منحني لتحريك قطع الجمجمة بعيدا. استخدام ملعقة لتجاهل المصابيح الشمية ونقل الجانب الظهري الدماغ تصل إلى لوحة 60 ملليمتر تحتوي على خمسة ملليلتر من GBSS الباردة. إدراج ملقط ناعم في المخيخ وإدراج ملعقة على طول خط الوسط لفتح نصف الكرة الأرضية بعناية.

استخدام ملقط منحني قصيرة لإزالة بعناية الأنسجة الزائدة التي تغطي قرن آمون دون لمس هيكل فرس النهر، ثم قطع تحت كل قرن آمون. نقل نصف الكرة الأرضية واحد في وقت قرن آمون الجانب صعودا وبالتوازي مع بعضها البعض على قطعة من ورق التصفية. ضع ورقة التصفية على مروحية نسيجية مع نصفي الكرة الأرضية عموديا على النصل وقطع نصفي الكرة الأرضية إلى شرائح 350 ميكرون.

نقل الأنسجة شرائح إلى طبق بيتري جديدة تحتوي على خمسة ملليلتر من GBSS الباردة واستخدام أقطاب طرف الجولة لفصل بعناية شرائح حفظ العينات فقط مع قشرة rhinal سليمة هيكليا وفرس النهر. وينبغي تحديد مناطق DG وCA بشكل مثالي وكذلك مناطق القشرة الأنف والهينية. استخدم ملعقة وقطبا كهربائيا مستديرا لوضع ما يصل إلى أربع شرائح سليمة على إدراج فردي في العدد المناسب من آبار لوحة سداسية البئر تحتوي على 1.1 ملليلتر من متوسط الثقافة لكل بئر.

استخدام ماصة P20 لإزالة أي وسيلة تشريح الزائدة من جميع أنحاء كل شريحة. ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية. تغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام.

استخدم ملقط لرفع إدراج. يستنشق المتوسط من البئر المقابلة ووضع إدراج مرة أخرى في مكانها. استخدام ماصة P1000 لإضافة ملليلتر واحد من الطازجة 37 درجة مئوية المتوسطة إلى كل بئر.

إعداد إعداد الفيزيولوجيا الكهربية في دائرة مغلقة. تحقق من أن معدل تدفق غرفة نوع الواجهة يتم تعيينه إلى ملليلترين في الدقيقة وفتح صمام الكربوهيدرات الثور. تحقق من مستوى المياه في النظام ووضع قطعة من ورق التصفية في غرفة تسجيل واجهة لاستنزاف أي وسيلة الزائدة.

ضع قطعة من ورق تنظيف العدسة أسفل الإطار لتوفير وسيطة للشريحة ثم قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة ومكبرات الصوت والمتلاعبات الصغيرة. استخدم حقنة لتحميل قطب زجاجي بسائل النخاع الاصطناعي الطازج. ضع القطب الزجاجي في القطب المستقبل وانتظر استقرار درجة الحرارة في غرفة الواجهة عند 37 درجة مئوية.

العمل في خزانة السلامة البيولوجية، ضع إدراج في لوحة 60 ملليمتر مع قطرة من المتوسط. استخدام شفرة حادة لقطع شريحة من إدراج ووضع شريحة في غرفة واجهة مع قرن آمون إلى أسفل اليمين، ثم وضع القطب المتلقي في طبقة الخلية الهرمية CA3، والشروع في بروتوكول الاستحواذ المستمر، وتسجيل شريحة لمدة 30 دقيقة. لإجراء فحص امتصاص يوديد البروبيديوم، اعمل في خزانة السلامة الحيوية.

رفع إدراج من البئر وإضافة يوديد البروبيديوم في المتوسط إلى تركيز النهائي من اثنين من الميكروفونر لكل بئر. يهيج ببطء لوحة قبل وضع إدراج مرة أخرى في البئر، مع الحرص على أنه لا توجد فقاعات تحت شرائح. عندما يتم علاج جميع الشرائح، أعد الطبق إلى حاضنة ثقافة الخلية.

لاحتواء المناعة من شرائح, في نهاية حضانة يوديد البروبيديوم, يستنشق المتوسط من أسفل كل بئر وإضافة ملليلتر واحد من 4٪ paraformaldehyde إلى أعلى وأسفل كل إدراج. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، اغسل الشرائح مرتين لمدة 10 دقائق وميليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل واستخدم قلما مسعورا لرسم مستطيلين على شرائح المجهر. استخدام شفرة حادة لقطع شرائح من إدراج ووضع شريحة واحدة في كل مستطيل.

أضف محلول حجب permeabilization إلى كل شريحة لاحتضان لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أضف الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية إلى كل شريحة لاحتضان أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، اغسل الشرائح مع PBS-Tween ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسل واحتضان الشرائح بالأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اغسل الشرائح كما هو موضح وأضف 50 ميكرولتر من محلول Hoechst إلى كل شريحة لاحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة Hoechst ، اغسل الشرائح مرة أخرى وأضف 50 ميكرولتر من المتوسط المتصاعد إلى كل واحدة ، ثم ضع غطاء فوق الشرائح وختم مع طلاء الأظافر. بعد السماح للشرائح لتجف لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، تصور امتصاص يوديد المناعة والبروبيديوم عن طريق المجهر confocal.

تصور شرائح الفص القشرة الحصين الوريدية العضوية النشاط المختلط بين الأسنان والهوتال في سبعة أيام في المختبر. وفي غضون 14 يوما في المختبر، يتسم النشاط العفوي بتصريفات تكنولوجيا المعلومات والاتصالات، التي تتطور إلى نشاط هائل في مجال تكنولوجيا المعلومات والاتصالات في المختبر لمدة 21 يوما مع أحداث ictal تستمر أكثر من دقيقة واحدة. الإقبال يوديد البروبيديوم والكيمياء المناعية ضد علامة الخلايا العصبية نيون كشفت بعض الموت العصبي في سبعة أيام في شرائح المختبر التي زادت بشكل كبير في 14 يوما في المختبر في جميع مناطق قرن آمون.

في سبعة أيام في المختبر، microglia ramified مع تعبير CD68 منخفضة هي أكثر وفرة من Iba1 CD68 إيجابية ميكروغليا التفاعلية الإيجابية. في حين أنه في 14 يوما في المختبر ، في جميع مناطق قرن آمون ، يتجاوز Iba1 الإيجابي CD68 amoeboid M1 microglia microglia مع تعبير CD68 منخفض. في 14 يوما في المختبر، يمكن تحديد بعض الخلايا الإيجابية CD68 إيجابية Iba1 مع ظهور فرط تشعبات، مما يشير إلى إمكانية النمط الظاهري M2 المضادة للالتهابات microglia.

في سبعة أيام في المختبر ، والتعبير عن CD3 بالكاد يمكن الكشف عنها ، في حين أنه في 14 يوما في شرائح المختبر ، يمكن ملاحظة فرط الرجفان الرجفي البروتين الحمضي إيجابية CD3 الخلايا الفلكية الإيجابية ، مما يشير إلى تفعيل التدريجي للخلايا الفلكية A1. إعداد شرائح قشرة قرن آمون rhinal بعناية فائقة. تأكد من إزالة الأنسجة الزائدة فوق قرن آمون لأنها يمكن أن تعرض للخطر سلامة شريحة أثناء تشريح.

وسوف يؤثر العجز البنيوي سلبا على قدرة الشرائح على البقاء. بالإضافة إلى النهج التي أظهرت، يمكن تطبيق عدد كبير من المقايسات مثل تحليل البقع الغربية، PCR في الوقت الحقيقي و ELISA على هذا النظام لمعالجة أسئلة محددة بشأن تكوين الصرع.