تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus
مايو 24, 2020
يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.
مهدت تقنيات الحقن المجهري للأجنة الطريق لتطوير العديد من أدوات مكافحة النواقل الجينية. على الرغم من أن العديد من أنواع الحشرات لديها بروتوكولات متطورة بالفعل ، إلا أن Culex quinquefasciatus لا يزال غير مدروس نسبيا. تم تصميم بروتوكول الحقن المجهري هذا خصيصا لاستيعاب السمات البيولوجية الفريدة ل Culex quinquefasciatus ، بما في ذلك جمع البيض ، وفصل طوف البيض ، وإجراءات ما بعد الحقن.
من المحتمل أن تتكيف هذه الطريقة مع أي نوع من أنواع Culex ذات الأهمية ، ويمكن استخدامها لدراسة وظيفة الجينات أو لتوليد تقنيات التحكم الجيني لأنواع Culex. ابدأ بفصل البيض عن الطوافات. استخدم ملقطا أو فرشاة رسم للضغط على الطوافة وتفكيك البيض الفردي.
قم بمحاذاة البيض على شريط رفيع من الشريط اللاصق على الوجهين يوضع على الجزء العلوي من شريحة زجاجية ، مع بذل جهد لتوجيه الجانب الأمامي من كل بيضة في نفس الاتجاه. تحضير مزيج الهالوكربون عن طريق خلط كواشف الهالوكربون برفق بالماء ، واحتضان الخليط عند 25 درجة مئوية طوال الليل. غطي البيض المحاذي بخليط زيت الهالوكربون.
لتوليد إبر للحقن المجهري ، ضع زجاجا شعريا من سيليكات الألومنيوم في مجتذب إبرة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. اضبط الحرارة على 560 ، والسرعة على 100 ، والتأخير على 70 ، واسحب إلى 97 ، والضغط على 500. ثم قم بتنشيط مجتذب الإبرة.
المس برفق طرف الإبرة المسحوبة على لوحة الكاشطة الماسية الدوارة لمدة 10 ثوان تقريبا بزاوية 50 درجة لشطبة طرف الإبرة. قم بتضمين الإبر المسحوبة والمشطوفة في خطوط من طين المصممين في طبق بتري. تحضير خليط الحقن المكون من كواشف تعديل الجينوم وتخزينه على الثلج.
استخدم طرف اللودر الدقيق لتحميل ميكرولترين من خليط الحقن في إبرة الحقن. ضع إبرة الحقن المملوءة في معالج دقيق مرتبط بحاقن دقيق إلكتروني وضع الشريحة الزجاجية مع البويضات المحاذاة على مسرح المجهر المركب. باستخدام المعالج الدقيق ، قم بمحاذاة الإبرة لتصويب الطرف الخلفي للجنين بزاوية 25 إلى 35 درجة.
أدخل الإبرة بعناية في الجنين وحقن الخليط بكمية حوالي 10٪ من حجم الجنين. حقن 20 بويضة في المرة الواحدة ، ثم توقف وقم بإجراء إجراءات استعادة الجنين. في غضون 20 دقيقة بعد الحقن ، قم بإزالة زيت الهالوكربون بعناية من البيض عن طريق تنظيفه برفق بفرشاة رسم نظيفة.
ارفعي البيض بفرشاة الرسم وضعيه في كوب من الماء المقطر المزدوج ، مع الحرص على إبقاء البيض على السطح. خلال الأيام السبعة التالية ، افحص البيض يوميا بحثا عن الفقس واتبع إجراءات تربية اليرقات العادية. فحص البعوض المحقون بحثا عن الأنماط الظاهرية الطافرة باستخدام مجسم مجسم.
تم استخدام هذه الطريقة لتوليد طفرات جسدية وجرثومية بنجاح لجين حاسم لتطور تصبغ العين الداكن. تم تسجيل الطفرات الجسدية الناتجة عن CRISPR-Cas9 عن طريق فحص فقدان التصبغ في عيون مرحلة حدقة العين للأفراد المحقنين. كانت الطفرات الجسدية موجودة بشكل عام كأنماط ظاهرية للفسيفساء ، حيث تحتوي بعض الخلايا وليس كلها على النمط الظاهري المتحور.
تم تحديد معدلات طفرات السلالة الجرثومية عن طريق تقاطع الفسيفساء G صفر الأفراد والتسجيل لكل ذرية بيضاء العينين تماما. أسفرت هذه التجارب عن معدل بقاء جنين يتراوح من 64 إلى 82٪ ، ومعدل طفرات جسدية يتراوح من 37 إلى 57٪ ، ومعدل طفرات أكثر من 61٪. من خلال تعدد إرسال sgRNAs لاستهداف مواقع متعددة في نفس الجين ، زادت معدلات الطفرات الجسدية والجرثومية إلى ما يصل إلى 86٪ بالإضافة إلى ذلك ، لأجيال عديدة ، تم الاحتفاظ بمخزونات متماثلة اللواقح قابلة للحياة من الطفرات البيضاء بنجاح في المختبر.
لتحسين معدلات البقاء على قيد الحياة والطفرات ، يجب تحضير جميع المواد ، بما في ذلك زيت الهالوكربون ، وسائل الحقن والإبر ، بشكل صحيح قبل محاولة الحقن المجهري. سيسمح ذلك بعملية حقن مجهري أكثر انسيابية وتركيزا.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول تقنيات الحقن المجهري لأجنة بعوض *Culex quinquefasciatus*، والتي تم تحسينها لتحرير الجينات باستخدام تقنية CRISPR/Cas9. وتتيح هذه التقنيات التوليد الفعال لطفرات سلالة جرثومية قابلة للتوريث لأغراض الأبحاث الجينية وتقنيات مكافحة النواقل.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الهندسة الوراثية
- بيولوجيا الناقلات
- تقنية CRISPR/Cas9
خلفية علمية
- تعد بعوضة Culex quinquefasciatus ناقلاً للأمراض لم يتم دراسته بشكل كافٍ.
- تعتبر تقنيات الحقن المجهري ضرورية لتطوير أدوات التحكم الجيني.
- توجد بروتوكولات قائمة ومستقرة لأنواع أخرى من الحشرات.
- تراعي هذه الطريقة السمات البيولوجية الفريدة لأنواع Culex.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول للحقن المجهري لـ Culex quinquefasciatus.
- تسهيل دراسات وظائف الجينات وتقنيات التحكم الوراثي.
- تحسين معدلات البقاء ومعدلات التطفير في الأجنة المحقونة.
الطرق المستخدمة
- تقنيات جمع البيض وفصل الطوف.
- تحضير زيت الهالوكربون ومزيج الحقن.
- الحقن المجهري للأجنة باستخدام المجهر المناول.
- فحص الأنماط الظاهرية الطافرة بعد الحقن.
النتائج الرئيسية
- تحقيق معدل بقاء للأجنة يتراوح بين 64-82%.
- تراوحت معدلات الطفرات الجسدية بين 37-57%.
- تجاوزت معدلات الطفرات في الخط الجرثومي 61%.
- أدى استخدام sgRNAs المتعددة إلى زيادة معدلات الطفرات لتصل إلى 86%.
الاستنتاجات
- ينجح هذا البروتوكول في توليد طفرات جسدية وطفرات في الخط الجرثومي.
- تم الحفاظ على سلالات متماثلة الزيجوت قابلة للحياة من الطفرات في المختبر.
- يؤدي التحضير السليم للمواد إلى تحسين عملية الحقن المجهري.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح الحقن المجهري الفعال للأجنة إجراء طفرات موجهة في مواقع محددة في بعوض *Culex quinquefasciatus*، وهو ناقل رئيسي لأمراض مثل فيروس غرب النيل وداء الفيلريات اللمفاوي. وتدعم هذه القدرة عملية التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة عن طريق توليد طفرات وراثية للدراسات الجينية الوظيفية. ويتناول هذا البروتوكول العوائق الخاصة بالنوع، مما يحسن الثقة التنبؤية في تحديد أهداف مكافحة النواقل وتطوير النماذج قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال التعطيل الجيني الدقيق في ناقل حشري ذي صلة بالمرض.
- القيمة التشغيلية: توفر طريقة قابلة للتكرار لتوليد طفرات في الخط الجرثومي للتحقق الوظيفي من الأهداف المشاركة في نقل الممرضات.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال ربط تعطيل الجينات بالنتائج المظهرية الحاسمة لكفاءة الناقل.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج قراءات طفرات قابلة للقياس الكمي (معدلات جسدية وجنسية) لتقييم كفاءة التعديل عبر تصميمات الحمض الريبوزي النووي الموجه (guide RNA).
- القيمة التشغيلية: يوحد معايير التعامل مع الأجنة وظروف الحقن، مما يحسن من إمكانية تكرار المقايسة عبر الدفعات التجريبية.
- القابلية للتوسع: يتيح توصيل sgRNA المتعدد لزيادة معدلات الطفرات، مما يدعم الفحص عالي الإنتاجية للأهداف.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: إنتاج طفرات موروثة ذات أعين بيضاء لإنشاء سلالات جينية مستقرة لإجراء دراسات طويلة الأمد حول المظاهر المورفولوجية وطرق الانتقال.
- القيمة التشغيلية: تحقيق معدلات بقاء للأجنة تتراوح بين 64–82%، مما يضمن توفير عدد كافٍ من الطفرات القابلة للحياة لإجراء الفحص المظهري اللاحق.
- الاستمرارية الانتقالية: الحفاظ على مخزونات حيوية من الطفرات متماثلة الزيجوت عبر الأجيال، مما يدعم التقييم قبل السريري لاستراتيجيات التحكم الجيني.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من فرضية الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، وذلك من خلال تمكين علم الجينوم الوظيفي في نوع من النواقل غير المدروسة بشكل كافٍ.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات عبر الطفرات الناتجة عن CRISPR/Cas9 لتوضيح وظيفة الجينات في التفاعلات بين الممرض والناقل.
- المسح: توفر معدلات طفرات كمية (37–57% جسدية، >61% سلالة جرثومية) لمقارنة فعالية RNA الموجه وتحسين ظروف التحرير.
- التحليلات: تتيح تقييم الأنماط الظاهرية الطافرة من خلال المسح المجسم، مما يوفر مخرجات قابلة للقياس للتحقق من النتائج الإيجابية.
- البحث الانتقالي: تسهل الاستمرارية من اكتشاف الجينات إلى تطوير النماذج قبل السريرية عن طريق توليد سلالات طافرة مستقرة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع سير عمل معياري للحقن المجهري قابل للتكيف عبر أنواع Culex، مما يقلل من التطوير المتكرر للبروتوكولات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الآلي من خلال تمكين الربط المباشر بين النمط الجيني والنمط الظاهري في نموذج لمرض ينقله ناقل.
- القيمة التشغيلية: يعزز إمكانية تكرار النتائج من خلال توحيد خطوات محاذاة البيض، وتغطية الهالوكربون، وتحضير الإبرة.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف عن طريق توفير التحقق الوظيفي من الأهداف الأساسية لبقاء الناقل أو انتقال الممرض.
- تأثير المحفظة البحثية: يتيح تحديد أولويات الأهداف المعدلة وفقاً للمخاطر بناءً على معدلات الطفرات المورثة وشدة النمط الظاهري.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الأجنة، والتلاعب الدقيق، والفحص الفلوري أو المجسم.
- يعتمد على جهاز سحب الإبر، والحقن الدقيق، وتحضير زيت الهالوكربون لضمان حيوية الأجنة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق في تقنيات جمع البويضات وفصل العوامات.
- قد يتطلب التكيف عبر أنواع Culex إجراء تعديلات على حجم الحقن وهندسة الإبرة.
- تشمل القيود العملية هشاشة الأجنة والحاجة إلى التعافي الفوري بعد الحقن للحفاظ على معدلات البقاء.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
