قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

وبما أن جزيء ATP رسول خلوي مهم، فقد طورنا طريقة تسمح لنا بقياس ارتباط جزيء ATP بمستقبلاته بدقة عالية. باستخدام FRET بين مشتقات النوكليوتيدات والبروتينات الموسومة بالفلورسنت ، يمكننا مراقبة ارتباط النوكليوتيدات بالمستقبلات الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي وبدقة مكانية ممتازة. نستخدم هذه الطريقة لفهم آثار التمثيل الغذائي الخلوي على قناة البوتاسيوم الحساسة ATP ، والتي تشارك في أشكال معينة من مرض السكري.

لإعداد تجربة غشاء غير مسقوف ، استخدم أولا زوجا من الملقط لكسر جزء صغير من زلة غطاء بخلايا منقولة وشطف الجزء باستخدام برنامج تلفزيوني. إذا كانت زلة الغطاء مغلفة مسبقا بالبولي ليسين ، فضع الجزء في قاع طبق 35 ملم يحتوي على ملليلتر من PBS وأمسك صوتي مسبار ثلاثة ملليمترات من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات فوق العينة ، ينبض عند 50 واط وسعة 20 إلى 40٪ لمدة 200 إلى 500 مللي ثانية لفتح الخلايا. إذا لم تكن زلات الغطاء مغلفة مسبقا ، بعد الشطف باستخدام PBS ، اغمس الجزء في أنبوب يحتوي على 0.1٪ poly-L-lysine لمدة 30 ثانية تقريبا قبل فتح الخلايا بصوتنة قصيرة كما هو موضح.

نقل جزء صوتنة إلى الزجاج المغطى أسفل 35 ملم طبق يحتوي على ملليلتر من محلول حمام وتركيب الطبق على المجهر المقلوب مجهزة بفتحة عددية عالية 60x هدف الغمر في الماء. تأكد من أن منفذ الكاميرا الخاص بالمجهر متصل بمطياف في سلسلة بكاميرا CCD عالية الحساسية واستخدم مضخة تمعجية لتغذية غرفة الحمام بمخزن مؤقت بمعدل تدفق يتراوح من 0.5 إلى ملليلتر واحد من المخزن المؤقت في الدقيقة. لتحديد شظايا الغشاء غير المسقوفة التي تعبر عن القناة المصنفة ANAP ، اعرض العينة لتحديد موقع الأغشية ذات القنوات الفلورية.

قم بإشراك قناع مقياس الطيف جزئيا بين منفذ الكاميرا على المجهر والمطياف. سيظهر ظل القناع على صورة الكاميرا. الحصول على حقل مشرق وصورة مضان للغشاء غير المسقوف للسماح باختيار المنطقة محل الاهتمام للتحليل.

اجعل طرف نظام التروية microvolume قريبا من الغشاء غير المسقوف. للحصول على صورة لمضان ANAP ، قم بإثارة الغشاء باستخدام مصباح LED 385 نانومتر من خلال مرشح إثارة تمرير نطاق 390/18 نانومتر وحافة ثنائية اللون 416 نانومتر ، وجمع الضوء المنبعث من خلال مرشح انبعاث طويل 400 نانومتر. قم بإشراك قناع مقياس الطيف وتأكد من مرور الضوء المنبعث.

قم بمحاذاة المنطقة محل الاهتمام مع شق قناع مقياس الطيف. إشراك حواجز شبكية الطيف. مع وجود حواجز شبكية في مكانها ، سيتم إسقاط الضوء المنحرف بواسطة مقياس الطيف على شريحة كاميرا CCD لإنتاج صور طيفية.

ستحتفظ الصور بالمعلومات المكانية في البعد Y. سيتم استبدال البعد X بالطول الموجي. أثناء الترشيح باستخدام محلول عازل خال من النوكليوتيدات ، احصل على واحد أو أكثر من التعرض من 0.1 إلى 10 ثوان لتصحيح المصب وتطبيع البيانات التي تم جمعها خلال بقية التجربة.

بعد ذلك ، قم بتطبيق مجموعة من تركيزات TNP ATP في محلول الاستحمام لإنشاء منحنى استجابة التركيز ، مع تعطير كل محلول لمدة دقيقة واحدة على الأقل لضمان الوصول إلى حالة مستقرة والحصول على تعرض لكل تركيز. بعد كل تركيز ، اغسل TNP ATP بمحلول حمام خال من النوكليوتيدات لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل الحصول على صورة التعرض بعد العلاج. لإجراء تجربة قياس الفلور بمشبك رقعة ، قم أولا بسحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات الجدران السميكة إلى مقاومة من 1.5 إلى 2.5 ميجاأوم عند ملئها بمحلول ماصة.

بعد ذلك ، قم بنقل زلة غطاء مع خلايا منقولة إلى طبق زجاجي 35 ملم يحتوي على ملليلتر من محلول الاستحمام وقم بتركيب الطبق على المجهر المقلوب. قم بتهوية غرفة الاستحمام بمحلول الاستحمام وحدد خلية تعبر عن القنوات المصنفة ANAP. ضع ضغطا إيجابيا لطيفا على ماصة التصحيح وضع الماصة في حجرة الاستحمام.

اضغط على الماصة على غشاء الخلية وقم بتطبيق شفط لطيف لتحقيق ختم جيجاأوم. لاستئصال الرقعة ، حرك حامل الماصة بسرعة بعيدا عن الخلية المرقعة. اجعل طرف ماصة الرقعة بالقرب من طرف نظام التروية ، وتحقق من أن الرقعة داخل شق قناع مقياس الطيف.

ثم قم بتطبيق TNP ATP وجمع أطياف الصور. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة جزء غشاء نموذجي غير مسقوف من خلية HEK293T يعبر عن قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP الموسومة ببروتين الفلورسنت البرتقالي. في هذه الصورة الطيفية لقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ANAP الموسومة ATP في غشاء غير مسقوف من خلية HEK293T معرضة لخمسة ميكرومولار TNP ATP ، يمكن ملاحظة منطقتين من الكثافة العالية التي تتوافق مع ذروة انبعاث ANAP و TNP ATP.

يمكن الحصول على طيف نهائي عن طريق طرح متوسط طيف الخلفية من متوسط طيف منطقة الاهتمام. هنا ، يمكن ملاحظة الانخفاض في ذروة مضان ANAP بعد التعرض المتعدد. تم تركيب ذروة التألق من عدة تعرضات في غياب TNP ATP على اضمحلال أسي واحد.

ثم تم استخدام هذه البيانات لتصحيح القطع الأثرية للتبييض الضوئي. هنا ، يتم عرض صور طيفية تمثيلية من غشاء غير مسقوف تم الحصول عليه من خلية تعبر عن ANAP الموسومة بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP في غياب ووجود TNP ATP. تكشف مراقبة أطياف الانبعاثات المصححة عن فصل واضح بين انبعاث الفلورسنت المانح والمتلقي.

في هذا الشكل ، يتم عرض التيارات والأطياف التمثيلية من ANAP الموسومة بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP من تجربة قياس فلوري نموذجية بمشبك رقعة. يتم تصحيح أطياف الانبعاث للخلفية والتبييض كما هو موضح للأغشية غير المسقوفة. توخ الحذر من عناصر التحكم للتحقق من أن إشارة الفلورسنت خاصة بالمستقبل.

تأكد من أن وفرة الخاصة بك سريعة وفعالة وكاملة والحفاظ على التعرض الخاص بك قصيرة قدر الإمكان. تجيب هذه الطريقة على أسئلة حول إشغال المستقبلات وكيفية ارتباطها بالوظيفة. يمكن لتقنيات FRET الأخرى المستخدمة مع إعداد مماثل أن تسبر التغييرات التأكيدية التي يسببها الرباط في المستقبل.