البراز (الصغير) عزل الحمض النووي الريبي

نقدم بروتوكولا لعزل الحمض النووي الريبي من عينات البراز لدراسة microRNAs. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي عن البراز بجودة وكمية عالية. يقلل من الحمض النووي الريبي من الميكروبات الحية.

من المهم التأكيد على ذلك ولا يتم استخدام المخزن المؤقت الملزم في هذا البروتوكول. هذا البروتوكول بسيط ومباشر. ابدأ بتعليق 25 إلى 100 ملليغرام من عينات البراز في 600 ميكرولتر من 1X DPBS المعقم في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر.

احتضان الأنبوب الذي يحتوي على العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم يهرس الخليط بطرف ماصة سعة مليلتر واحد ودوامة جيدا. أعد تعليق الخليط في الخالط مع إعداد لدورة واحدة عند 4 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية لتحسين وزيادة كمية وجودة الحمض النووي الريبي.

أضف 600 ميكرولتر من محلول كلوروفورم الفينول الحمضي إلى العينة وقم بتدوير الخليط لمدة 60 ثانية. بدلا من ذلك ، لتحسين كمية متزايدة من الحمض النووي الريبي في المحصول ، قم بخلطها مع الخالط. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة عند 10 ، 000 × جم في درجة حرارة الغرفة لفصل الطور المائي والعضوي.

كرر الطرد المركزي حتى تصبح الواجهة مضغوطة. انقل المرحلة المائية العلوية بعناية دون إزعاج المرحلة السفلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة ملليلتر بغطاء مفصلي. أضف ACS الصف 100٪ إيثانول عند 1.25 × حجم الطور المائي المكتسب والدوامة لمدة ثلاث ثوان.

ضع خرطوشة الفلتر في أنابيب التجميع. قم بتحميل 600 ميكرولتر من كل عينة في خرطوشة المرشح المتوفرة في مجموعة عزل microRNA. جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة 90 ثانية لتصفية الخليط من خلال الخرطوشة.

ثم تخلص من المرشح. كرر هذا حتى يتم ترشيح الحجم الكامل للخليط من خلال نفس غشاء المرشح في التطبيقات المتتالية. بعد كل شيء يتم تصفية العينة.

أضف 700 ميكرولتر من محلول غسيل microRNA 1 في نفس خرطوشة الفلتر. جهاز طرد مركزي لمدة 60 ثانية لتصفية محلول الغسيل من خلال خرطوشة الفلتر. تخلص من المرشح وضع خرطوشة الفلتر على نفس أنبوب التجميع.

اغسل خرطوشة الفلتر ب 700 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 المحضر من الإيثانول 100٪ من ACS وأجهزة الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة. تخلص من المرشح الذي تم الحصول عليه وضع خرطوشة الفلتر في نفس الأنبوب. اغسل خرطوشة الفلتر ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 وجهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة.

تخلص من المرشح الذي تم الحصول عليه وضع خرطوشة الفلتر في نفس أنبوب التجميع. اغسل خرطوشة الفلتر ب 250 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 المحضر من الإيثانول 100٪ من ACS وأجهزة الطرد المركزي عند 10 ، 000 × جم لمدة دقيقة. تخلص من المرشح الذي تم الحصول عليه وضع خرطوشة الفلتر في نفس أنبوب التجميع.

أخيرا ، انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد وقم بتدوير المجموعة لمدة خمس دقائق لإزالة السائل المتبقي. انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد ثم أضف 50 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى وسط الفلتر وقم بتغطية الأنبوب. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة خمس دقائق عند 8 ، 000 × جم لاستعادة الحمض النووي الريبي في أنبوب تجميع جديد. يشير اختبار الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة للحمض النووي الريبي إلى أن عزلات الحمض النووي الريبي التمثيلية من براز الفئران والإنسان منخفضة أو تفتقر إلى تركيبات 18S و 28S rRNA وأن حجم عزلات الحمض النووي الريبي يقع في منطقة الحمض النووي الريبي الصغيرة. كشف الرحلان الكهربائي للحمض النووي الريبي الصغير الآخر مع الرحلان الكهربائي القائم على الرقاقة أن جزءا كبيرا من الحمض النووي الريبي بحجم الحمض النووي الريبي الصغير.

كان نقاء الحمض النووي الريبي المستخرج مرتفعا كما يتضح من نسبة الامتصاص 2.0 للأطوال الموجية 260 و 280 نانومتر وقيمة نسبة 1.8 للامتصاص عند 260 و 230 نانومتر. لضمان نجاح الاستخراج العضوي ، تأكد من أن الوجوه واضحة ولا تنقل إلا الطور المائي العلوي دون إزعاج المرحلة السفلية ، حتى على حساب حجم منخفض من الطور المائي.