تنقية الأنسجة المستندة إلى الوضوح لمنظمة الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد في قلوب الفئران الصحية والمصابة
مايو 16, 2021
تم تطوير طريقة مكررة لإزالة الأنسجة وتطبيقها على قلب الماوس البالغ. تم تصميم هذه الطريقة لمسح كثيفة، والأنسجة القلبية autofluorescent، مع الحفاظ على مضان الخلايا الليفية المسمى يعزى إلى استراتيجية مراسل الجينية.
يحسن بروتوكول إزالة الأنسجة الجديد هذا التكنولوجيا الحالية للسماح بالنظر بشكل أكثر دقة في الجسم الحي إلى أنواع خلايا محددة في القلب وسلوكها في ظل ظروف الإصابة. هذا البروتوكول سريع وبسيط إلى حد ما. فإنه يسمح للحفاظ على مضان ماركا مع الحد الأدنى من التدخل من الفلورسينس السيارات الأنسجة الخلفية دون الحاجة إلى تلطيخ الخلايا أو الأنسجة.
ابدأ باستخدام وسادة شاش غارقة في الإيثانول بنسبة 70٪ لتنظيف السطح البطني للفأر التجريبي. استخدام مقص الجراحية لجعل شق عرضية ثلاثة سنتيمترات، ما يقرب من ثلاثة أمتار تحت عملية xiphoid و deglove الماوس من البطن إلى عملية xiphoid لفصل الجلد من أنسجة جدار البطن الكامنة. إجراء شق عرضي سنتيمترين في نسيج جدار البطن تحت الجلد، ثلاثة سنتيمترات تحت عملية xiphoid وجعل قطع عمودي من هذا الشق حتى خط الوسط من خلال القفص الصدري.
ثبت القفص الصدري مرة أخرى لفضح القلب. واستخدام حقنة 10 ملليلتر مجهزة إبرة قياس 27 لحقن برنامج تلفزيوني الباردة في كافا فينا متفوقة وorta. عندما يتم مسح كل من الدم من القلب، وتقديم 10 ملليلتر من البرد 4٪ PFA في الكافا فينا متفوقة والهرطية لبدء عملية التثبيت.
عندما تومض كل من المثبتة، استئصال القلب واستخدام مشرط شفرة مستقيمة لفصل الأذين والبطين الأيمن والحاجز والبطين الأيسر. ضع القلب في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر من PFA الباردة 4٪ لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على نوتاتور. في صباح اليوم التالي، إضافة 0.25٪ حل البادئ الصورة إلى حل الهيدروجيلات أعدت حديثا ونقل القلب إلى هلام المائية.
التفاف أنبوب مخروطي في احباط لاحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية دون اضطراب جسدي. في صباح اليوم التالي دافئة الأنبوب في حمام حبة 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة قبل استخدام ملقط لنقل القلب بعناية إلى أنبوب 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. غسل القلب ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة لكل غسل في 37 درجة مئوية على نوتاتور ونقل القلب إلى سلة من آلة الكهربائي النشط.
تأمين الغطاء في مكان وملء خزان غرفة الكهربائي النشط مع محلول إزالة الكهربائي. بمجرد أن تمتلئ الغرفة ، اغمر السلة في المحلول وشد الغطاء على آلة الكهربائي في مكانه. ثم تشغيل آلة الكهربائي في 1.5 أمبير و 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
بعد الإلكتورفوريز، تحقق من القلب بصريا للتأكد من عدم وجود أنسجة مبهمة. غسل القلب مسح ثلاث مرات في 15 ملليلتر اثنين لمدة ساعة واحدة في برنامج تلفزيوني جديد في 37 درجة مئوية لكل غسل على نوتاتور. قبل غمر القلب في عامل إزالة اللون للحد من مضان السيارات هيم.
بعد 48 ساعة، اغسل القلب ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح وتوازن القلب في RIMS المعدة حديثا لمدة 48 ساعة قبل التصوير. للتصوير ثلاثي الأبعاد للقلب المطهي، أولا، ضع طبقة رقيقة من الشحوم الفراغية على الجزء السفلي من خزان قاع مطبوع ثلاثي الأبعاد، وهو نفس ارتفاع العينة التي يتم تصويرها. ملء الخزان مع RIMS واستخدام تلميح ماصة لإزالة أي فقاعات.
ضع القلب بعناية في RIMS مع الجدار البطيني الأيسر المواجه لأعلى ، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الحل. استخدام الشحوم فراغ لإرفاق زلة غطاء زجاجي إلى السطح السفلي من قطعة خزان أعلى المطبوعة 3D ووضع غطاء الخزان العلوي أسفل على الخزانات السفلية، مع الحرص على تجنب فقاعات. ثم ملء الخزانات الأعلى مع الجلسرين.
استخدام المجهر confocal لتصوير قلوب مسح. الجمع بين تطهير الأنسجة القلبية المكررة مع التصوير ثلاثي الأبعاد يسمح بتصور مفصل متقدم للخلايا الليفية القلبية. باستخدام تقنية التصوير هذه ، لوحظ أن الخلايا الليفية معبأة بكثافة وأن يكون لها مورفولوجيا مغزلية في قلوب غير مصابة.
بعد إصابة إعادة التروية ، يتم رؤية فقدان الخلايا الليفية القلبية في المنطقة الإقفارية في الأيام الثلاثة الأولى بعد الإصابة. وبحلول اليوم السابع وال14، هاجرت الخلايا الليفية أو انتشرت لإعادة إسكان منطقة الأنسجة المصابة. بحلول اليوم 28 ، يكون عدد الخلايا الليفية القلبية المحيطة بالمناطق المصابة في القلب في أكبر كثافة لها.
بعد يوم ونصف من إصابة احتشاء عضلة القلب، لا تزال الخلايا الليفية قليلة داخل البطين الأيسر المصاب. بحلول اليوم الثالث ومع ذلك ، فإن الخلايا الليفية توسيع ومتواجدة في معظم البطين الأيسر. على النقيض من الجراحة الإقفارية ، فإن ضخ أنجيوتنسين اثنين وفينولفرين على مدى عدة أسابيع لا يؤدي إلى فقدان أنسجة القلب وترقق الجدار.
بدلا من ذلك، محاذاة الخلايا الليفية على طول محور اليد اليمنى نمط انكماش الحلزون كما رأينا عند استخدام المكرر إلى بروتوكول إزالة الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، بعد علاج أنجيوتنسين اثنين وفينولفيرين، تظهر الخلايا الليفية صغيرة وتقريبها بدلا من شكل المغزل لوحظ في نماذج من إعادة التروية وإصابات احتشاء عضلة القلب. يجب إجراء المقاصة الكهربائية بعناية خاصة عند العمل مع القلوب التي خضعت لبروتوكولات الإصابة.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم كيفية تفاعل الخلايا الليفية القلبية مع الإصابة في الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام علامات فلورية مختلفة لفهم كيفية استجابة القلب للإصابة على المستوى الخلوي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تم تطوير طريقة منقحة لشفافية الأنسجة في قلب الفأر البالغ، مما يسمح بتصوير أنواع محددة من الخلايا مع تقليل التألق الذاتي للخلفية. يعزز هذا البروتوكول التقنيات الحالية لدراسة أنسجة القلب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- هندسة الأنسجة
خلفية علمية
- تعد تقنيات تصفية الأنسجة أساسية لتصوير الأنسجة البيولوجية الكثيفة.
- يمكن أن يؤدي التألق الذاتي إلى حجب إشارات خلوية محددة في دراسات التصوير.
- يعد الحفاظ على تألق الخلايا المصبوغة أمراً حاسماً لتحقيق تحليل دقيق.
- قد تتطلب الطرق الحالية إجراء عملية صبغ، مما يزيد من تعقيد العملية.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول سريع وبسيط لترويق الأنسجة.
- تحسين تصوير تألق الخلايا الليفية في أنسجة القلب.
- تقليل تداخل الخلفية الناتج عن التألق الذاتي.
الطرق المستخدمة
- استخدام ethanol بتركيز 70% لتنظيف السطح البطني للفأر.
- إجراء الشقوق الجراحية للوصول إلى القلب.
- تطبيق بروتوكول الشفافية المبتكر على أنسجة القلب.
- الحفاظ على الفلورة العلامية دون صبغ.
النتائج الرئيسية
- نجح البروتوكول الجديد في إزالة العتامة من أنسجة القلب الكثيفة بشكل فعال.
- تم الحفاظ على تألق الخلايا الليفية خلال هذه العملية.
- انخفض التألق الذاتي للخلفية بشكل ملحوظ.
- تسمح هذه الطريقة بتصوير الخلايا القلبية في الجسم الحي بشكل أفضل.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الطريقة المحدثة دراسة أنسجة القلب.
- وهي توفر أداة قيمة للباحثين الذين يدرسون استجابات إصابات القلب.
- يتميز هذا البروتوكول بالكفاءة ويقلل من الحاجة إلى عمليات صبغ إضافية.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر فهم ديناميكيات الخلايا الليفية القلبية في ثلاثة أبعاد رؤى بالغة الأهمية حول آليات التليف التي تؤدي إلى تصلب البطين وتطور فشل القلب. يتيح نهج توضيح الأنسجة المطور والمبني على تقنية CLARITY تصويراً عالي الدقة للعضو بأكمله لسلوك الخلايا الليفية دون قيود في اختراق الأجسام المضادة أو فقدان في الفلورة، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية في التحقق من أهداف القلب والأوعية الدموية. توفر هذه الطريقة قيمة تنبؤية من خلال الكشف عن استجابات الخلايا الليفية المحددة مكانياً لنماذج الإصابة الإقفارية وغير الإقفارية، مما يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف في مراحل الاكتشاف المبكرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء تموضع الخلايا الليفية ومورفولوجيتها في الأنسجة السليمة لتوضيح الأدوار المسببة للمرض مقابل الأدوار الترميمية في التليف القلبي.
- القيمة التشغيلية: يدعم التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال ربط الوسم الجيني للخلايا الليفية (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) بالأنماط الظاهرية المكانية في القلوب السليمة والمصابة.
- الثقة التنبؤية: يكشف عن أنماط الخلايا الليفية الخاصة بالإصابة — مثل النطاقات المصطفة بعد حقن angiotensin II/phenylephrine أو إعادة التوطين من المناطق الحدودية بعد نقص التروية — لتقليل المخاطر المرتبطة بالفرضيات الميكانيكية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج قلوباً مُصفّاة وموسومة فلوريسنتياً متوافقة مع التصوير البؤري لغرض التحليل الكمي ثلاثي الأبعاد لكثافة الخلايا الليفية وتوزيعها وشكلها.
- القابلية للتكرار: يضمن التصفية القياسية القائمة على الرحلان الكهربائي (1.5 amps، 37°C، 1.5 hours) ومعادلة RIMS خصائص بصرية متسقة للأنسجة عبر المجموعات التجريبية.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع معالجة العينات المتعددة في غرف الرحلان الكهربائي النشط، مما يتيح المقارنة جنباً إلى جنب بين نماذج التحكم، والإصابة بنقص التروية، والإصابة بفرط ضغط الدم.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- النظام ذو الصلة بالمرض: يرصد استجابات الخلايا الليفية في نماذج تحاكي الإصابة بنقص التروية البشرية (إعادة التروية) وفرط الضغط (أنجيوتنسين II/فينيل-إيفرين)، وهو ما يتماشى مع الأنماط الظاهرية للتليف السريري.
- الاستمرارية الترجمية: يتتبع موت الخلايا الليفية، وإعادة توطين المنطقة الحدودية، وذروة الكثافة في اليوم 28 بعد نقص التروية، وهي نوافذ زمنية رئيسية لاختبار التدخلات المضادة للتليف.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يميز بين الخلايا الليفية المغزلية المحفزة للتليف في حالات نقص التروية والأنماط الظاهرية الصغيرة والمستديرة في حالات ارتفاع ضغط الدم، مما يوجه عملية تعديل المسارات الخاصة بالأهداف المحددة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث توفر بيانات مظهرية ذات دقة مكانية تربط بين النتائج المختبرية (in vitro) والمخرجات الوظيفية في النماذج قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح اختبار الفرضيات المتعلقة بتنشيط الخلايا الليفية وهجرتها وتكاثرها في سياق نسيجي ثلاثي الأبعاد، مما يوضح مساهمات المسارات على مستوى التليف.
- الفحص المسحي: تُنتِج مخرجات تصوير كمية (كثافة الخلايا الليفية، واصطفافها، ومورفولوجيتها) مناسبة للتحليل عالي المحتوى في سلسلة عمليات فحص المركبات.
- التحليلات: تدعم التحليل المورفومتري والإحصائي المكاني لشبكات الخلايا الليفية، مما يسمح بالمقارنة بين الأنماط الجينية والإصابات والنقاط الزمنية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط ديناميكيات الخلايا الليفية بالجداول الزمنية لإعادة تشكيل البطين، مما يدعم التحقق قبل السريري المتوافق مع المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتصفية الأنسجة وتصويرها، يمكن تطبيقها على نماذج متعددة لأمراض القلب والأوعية الدموية وأنواع خلوية أخرى تتجاوز الخلايا الليفية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في وظيفة الخلايا الليفية من خلال الحفاظ على بنية الأنسجة الأصلية وسلامة الإشارة الفلورية.
- القيمة التشغيلية: يلغي الحاجة إلى التقطيع والتلوين، مما يقلل من تباين سير العمل ويزيد من إنتاجية التنميط الظاهري ثلاثي الأبعاد.
- القيمة الاستراتيجية: يعزز الثقة في قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال الكشف عن استجابات الخلايا الليفية المستهدفة التي تتنبأ بالنتائج الوظيفية في نماذج فشل القلب.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد الأولويات للأهداف المضادة للتليف بناءً على تقييم المخاطر، وذلك استناداً إلى الارتباط بالهدف والتحوير المظهري الموثق مكانياً.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في جراحة القلب لدى الفئران، والتثبيت بالتروية، وتقنيات جعل الأنسجة شفافة القائمة على الهيدروجيل.
- يعتمد على توفر أجهزة الرحلان الكهربائي النشط، والمجهر البؤري (confocal microscopy)، ومحاليل التركيب RIMS/glycerol.
- يستلزم توحيد مدة ودرجة حرارة عملية جعل الأنسجة شفافة لمنع الإفراط في الشفافية أو حدوث التألق الذاتي في الأنسجة المصابة.
- قد يتطلب التكيف مع نماذج مرضية أخرى تحسين وقت إزالة اللون لتقليل الخلفية المشتقة من الهيم دون إخماد إشارة GFP.
- قيد عملي: تعتمد استقرارية التصوير على المدى الطويل على توازن RIMS الصحيح لمنع عدم تطابق معامل الانكسار وتدهور الإشارة.
