تصور وقياس الأضرار التي لحقت بالحمض النووي الخاصة بالموقع القائم على الإندونوكليز

يقدم هذا الفيديو المنهجية الخطوات الحاسمة لبروتوكولات التنسيب المناعي والكروماتين المناعي المستخدمة بانتظام لدراسة العملية الخلوية المرتبطة بتلف الحمض النووي وتصور وتحديد كمية توظيف البروتينات المتورطة في إصلاح الحمض النووي. توفر هذه التقنية أدوات قوية للباحثين لتحديد البروتينات الجديدة المرتبطة بالمجراد الجينومي التالف ، بالإضافة إلى تعديلاتها بعد الترجمة اللازمة للتنظيم الدقيق أثناء إصلاح الحمض النووي. وبما أنه يمكن تطبيق هذه التقنيات لدراسة العمليات الخلوية المختلفة، فإن لها صلة محتملة إذا تم استخدام أنظمة ليزر ميكرويررايدييشن أو الحمض النووي القائم على النواة.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من الأدوات القوية للحث على تلف الحمض النووي الخاص بالموقع الذي يمكن استخدامه لتوسيع فهمنا لإصلاح الحمض النووي. تطبيق النهج الكيميائية الحيوية والجينية، وهذه الأواني ضرورية في الكشف عن الأحداث الخلوية المرتبطة تجنيد وتجميع مجمعات إصلاح الحمض النووي في موقع تلف الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه التقنيات لدراسة هذه العمليات في قرار خلية واحدة باستخدام كل من الخلايا الثابتة والحية.

الحفاظ على خلايا U2OS في monolayers في DMEM ثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل العجل الجنيني، 2 الجلوتامين ملليمولار، والحل المضاد للمضادات الحيوية 1٪. تنمو الخلايا في بيئة رطبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة حتى يتم تحقيق التقاء 80٪، وتجديد المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام. يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.

فصل الخلايا مع حل تريبسين-EDTA. عندما تنفصل الخلايا، أوقف نشاط التريبسين بإضافة وسائط الثقافة إلى الخلايا، مما يؤدي إلى تعليق الخلية. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا.

لوحة 20، 000 خلية لكل ملليلتر لكل بئر على لوحة 24 جيدا مع العقيمة 12 ملليمتر انزلاقات الغطاء المستدير في كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪ الرطبة للسماح المرفق على زلات الغطاء. علاج الخلايا مع 10 نانوغرام لكل النيوكارزينوستاتين ملليلتر أو استخدام الطريقة المناسبة للحث على فواصل حبلا مزدوجة عن طريق النظم القائمة على الاندونوكلوز.

احتضان الخلايا لمدة ساعة إلى ثماني ساعات في 37 درجة في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪ الرطبة لمتابعة الحركية لإصلاح الحمض النووي. إصلاح الخلايا مع 4٪ حل برنامج تلفزيوني الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة في 25 درجة. إزالة حل تحديد وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منهما.

إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.2٪ تريتون X حلها في برنامج تلفزيوني. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.

منع ملزمة غير محددة مع 5٪ BSA المخفف في BSA-PBST واحتضان العينات لمدة 20 دقيقة على الأقل. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية المخففة في 1٪ BSA-PBST الحل. ضع كل غطاء ينزلق رأسا على عقب على بارا فيلم أو 10 قطرة ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف.

احتضان العينات في غرفة الرطوبة لمدة ساعة ونصف الساعة في أربع درجات. وضع الغطاء ينزلق مرة أخرى يجري الجانب حتى في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 1٪ BSA-PBST.

ضع كل غطاء ينزلق رأسا على عقب على parafilm على قطرة 10 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف. احتضان العينات في غرفة الرطوبة في أربع درجات لمدة ساعة. ضع الغطاء ينزلق مرة أخرى يجري إعدادها في لوحة 24 جيدا وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.

قبل إزالة آخر حل الغسيل PBS، تأخذ بلطف من زلات الغطاء مع نصف ملاقط وإبرة، ومن ثم وضعها رأسا على عقب على الشرائح الزجاجية مع قطرات من المتوسطة المتصاعدة. الكروماتين المناعي هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد أنماط ملزمة من البروتينات للحمض النووي. للكشف عن إشغال بروتين إصلاح الرغبة حول DSB ، يتم استخدام جهاز مضاد محدد لprecipitate البروتين المهم من إعداد الكروماتين جنبا إلى جنب مع منطقة الحمض النووي التي يرتبط بها.

وعلاوة على ذلك، يطبق برنامج التحمل المشترك عادة لرسم خريطة لوجود تعديل محدد بعد الترجمة في استخدامه من قبل هيئات خدمة المركبات في مكان معين من الجراد الجينومي. وينبغي استزراع ما يقرب من 20 مليون خلية لكل ملليلتر في طبق طوله 15 سنتيمترا لكل عينة. إزالة الثقافة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع الجليد البارد PBS.

إصلاح الخلايا مع 1٪ حل الفورمالديهايد-برنامج تلفزيوني. ضع اللوحة على شاكر مداري واهيج بلطف لمدة 20 دقيقة. وقف التثبيت مع الجليسين للوصول إلى تركيز النهائي من 125 ملليمولار واحتضان على شاكر المداري مع التحريض لطيف لمدة خمس دقائق في 25 درجة.

ضع الطبق على الجليد واغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد. كشط الخلايا في الجليد البارد PBS ونقلها إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. طرد الخلايا في 5000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في أربع درجات.

يستنشق بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في اثنين من تحلل الخلية ملليلتر العازلة واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 5,000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق بأربع درجات. تجاهل بعناية supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 500 إلى 1، 500 ميكرولتر تحلل النووية العازلة واحتضان على الجليد لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

نقل الليسترات إلى أنبوب البوليسترين المخروطية مناسبة ل sonication. Sonicate lysate لقص الحمض النووي إلى متوسط حجم جزء من 300 إلى 1000 أزواج قاعدة. إعداد Dynabeads لخطوات ما قبل التنظيف والمناعة.

غسل الخرز مرتين لمدة 10 دقائق في أربع درجات مع العازلة RIPA. Resuspend Dynabeads في نفس حجم المخزن المؤقت RIPA كما كنت أخذت من حل المخزون الأصلي في الخطوات 3.1. مسح مسبق 25 إلى 30 ميكروجرام كروماتين من كل عينة مع أربعة حبات ديناباز ميكروليتر عن طريق التناوب لمدة ساعة إلى ساعتين في أربع درجات.

عجل Dynabeads مع المغناطيس ونقل supernatant إلى أنبوب Eppendorf جديدة. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة لكل عينة الكروماتين وتدوير بين عشية وضحاها في أربع درجات. في اليوم التالي، أضف 40 ميكرولتر من حبات الدينابيد المغسولة إلى كل عينة واحتضانها بين عشية وضحاها بالتناوب في أربع درجات.

يغسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر منخفض الملح العازلة لمدة 10 دقائق مع دوران في أربع درجات. يغسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر عالية الملح العازلة لمدة 10 دقائق مع التناوب في أربع درجات. يغسل مرة واحدة مع 300 ميكرولتر كلوريد الليثيوم العازلة لمدة 10 دقائق مع التناوب في أربع درجات.

اغسل مرتين مع 300 ميكرولتر TE لمدة 10 دقائق مع دوران للغسيل الأول في أربع درجات والغسيل الثاني عند 25 درجة. إضافة 200 ميكرولتر elution العازلة إلى الخرز واحتضانها في 65 درجة في الحرارة شاكر لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز مستمر. نقل supernatant إلى أنبوب جديد والخرز elute مرة أخرى في 200 ميكرولتر elution العازلة.

إضافة 500 ميكروغرام لكل بروتين المليلتر-K ونصف في المئة SDS واحتضان العينات في 50 درجة لمدة ساعتين. تنفيذ استخراج الكلوروفورم ونقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب Eppendorf جديدة. إضافة حجمين ونصف من الإيثانول المطلق و 0.1 المجلد الثالث خلات الصوديوم المول خلات 5.2.

احتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في ناقص 80 درجة. إزالة الإيثانول والهواء الجاف بيليه. Resuspend بيليه في 50 ميكرولتر TE. لدراسة توزيعها الخاص على الحمض النووي ، يجب تطبيق الاختصاص المناعي للكروماتين.

يتم عرض نتائج تجريبية نموذجية حصل عليها ChIP-qPCR في هذا الرقم ، مما يدل على الإثراء الزمني لغاز غاما الهستون AX كرد على تلف الحمض النووي المستحث الناجم عن I-PpoI. في الجزء الأيسر من الصورة، تظهر إشارة جاما هيستون AX المكتشفة في الوقت المناسب في جانب الكسر، بينما في الجزء الأيمن، يتم تقديم توزيع جاما لهستون AX في منطقة جين التحكم التي لم يتم فيها حدوث فواصل موضحة. على الرغم من أن إصلاح الحمض النووي هو مجال بحثي حديث نسبيا ، إلا أن معرفتنا تتزايد بسرعة بمساعدة كل من الأساليب الكيميائية الحيوية والمجهرية.

ومع ذلك، تتطلب التقنيات الكيميائية الحيوية، مثل البقعة الغربية، وسرعة المناعة، وقياس الطيف الكتلي كمية كبيرة من الخلايا. تمثل عمليات إصلاح الدراسة لقطة من مجموعة الخلايا المرغوبة. وقد أحدث المجال المجهري ثورة في التقنيات عالية الدقة، مثل المجهر فائق الدقة، الذي يسمح بتصور العمليات الخلوية الناجمة عن تلف الحمض النووي على المستوى النووي، فضلا عن ضمان رسم خرائط دقيقة لتوطين البروتين المشترك.

من ناحية أخرى ، فإن التكفير المناعي للكروماتين هو أداة قوية ، خاصة من خلال الجمع بينه وبين طرق التسلسل لتصور نمط الربط على نطاق الجينوم للبروتينات ذات الصلة بإصلاح الحمض النووي المطلوب وفواصل حبلا مزدوجة في مناطق الكروماتين أو هيتيركروماتين.