إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

مرحبا، ومرحبا بكم في هذا الفيديو JoVE". نريد أن نقدم لكم الإعداد الذي لدينا هنا لصنع الشبكة السريعة، دراسة حلها الزمن التي نحن تطوير أكثر في ليدز. كن على علم بأن هذا ليس نظاما قياسيا ، ولكننا نأمل أنه من خلال إعطائك سردا مفصلا لجميع الأشياء والمعلمات التي نقوم بها ، ستتمكن من تطوير أنظمة مماثلة في مختبراتك الخاصة.

ويرد وصف مفصل للجهاز في بروتوكول ريتشموند. هنا، نحن ذاهبون لإعطاء دليل خطوة بخطوة لإعداد الشبكة بسرعة وEM حل الوقت. في تجربتنا، يجب أن يكون تركيز البروتين اثنين ملليغرام لكل ملليلتر أو أعلى. يتطلب البروتوكول حدا أدنى من الحجم يبلغ حوالي 50 ميكرولتر.

قم بتشغيل الجهاز. ثم قم بتشغيل جهاز التحكم وبدء تشغيل برنامج التحكم. تهيئة جميع مضخات الحقنة عن طريق الضغط على زر التهيئة على كل مضخة حقنة.

قم بتشغيل مصدر الطاقة القوي، واضبطه على تسع فولتات، وابدأ تشغيل برنامج التحكم في الذبذبات. هناك حاجة إلى غاز النيتروجين المضغوط لتوليد رذاذ. فتح اسطوانة النيتروجين وتعيين الضغط إلى 2 شريط.

تأكد من أن جميع صمامات مضخة المحاقن في وضع الحمل. للقيام بذلك، قم بتبديل كافة الصمامات للاستغناء في برنامج التحكم ومن ثم العودة إلى التحميل. تعيين جميع المحاقن إلى الصفر.

وينبغي إزالة أي فقاعات الهواء الموجودة في النظام في هذه المرحلة. للقيام بذلك قد يكون المحاقن فك، فقاعات إزالتها يدويا، والمحاقن التي شنت مرة أخرى عند احتواء لا مزيد من الفقاعات. عادة ما يتم تخزين نظام المناولة السائلة في الماء.

قبل تحميل العينة، يتم دقة النظام مع المخزن المؤقت. ويتم ذلك عن طريق غسل الأنابيب مع فائض من العازلة. ضع أنبوب يحتوي على ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من العازلة على حقنة واحدة.

يجب أن تكون مثقوبة الجزء العلوي من الأنبوب لإرفاقه. يستنشق كمية مناسبة من العازلة، بين 50 و 100 ميكرولتر مع حقنة واحدة باستخدام برنامج التحكم. تبديل صمام واحد للاستغناء.

الاستغناء عن كل من السائل في حقنة واحدة. عودة صمام واحد إلى موقف الحمل، واضغط على زر تهيئة على حقنة واحدة لإعداد النظام لدورة الغسيل المقبل. وعادة ما تتكرر هذه الخطوات ثلاث مرات لضمان غسل شامل للأنابيب.

بعد ذلك ، يتم وضع فوهة الرش. ضع شبكة EM في الذراع المنغمسة. ضع الشبكة أمام فوهة الرش.

الاستغناء عن المخزن المؤقت باستخدام برنامج التحكم. إذا تم محاذاة الفوهة والشبكة ، يجب أن يتراكم السائل بعد الرش لفترة طويلة من الزمن. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع الفوهة ثم تحقق مرة أخرى من مكان تراكم السائل على الشبكة.

بعد ذلك، ضبط موقف كأس الإيثان. يجب أن تصل أطراف الملاقط إلى مركز كأس الإيثان تقريبا. قم بإجراء اختبار للتأكد من صحة كافة الإعدادات.

أغلق غرفة الرطوبة. تأكد من أن مسار المكبس واضح. يستنشق حجم المخزن المؤقت المطلوب لتشغيل واحد في حقنة واحدة.

تبديل صمام واحد للاستغناء. بدء التشغيل بالضغط على run'in برنامج التحكم. تحقق من أن مضخة حقنة واحدة تتحرك، ثانيتين في هذه الحالة، ويتم هوت الشبكة بعد تأخير مناسب، 1.5 ثانية هنا.

عند الانتهاء من تشغيل، تعيين الضغط على ذراع المكبس إلى القيمة المطلوبة. اضغط OK'in برنامج التحكم لتحرير الضغط من الذراع يغرق. الآن كأس الإيثان بارد ومليء بال إيثان السائل.

توهج التفريغ الشبكات قبل الاستخدام. وتوهج نموذجي التفريغ هو 90 ثانية في 10 مللي أمبير في الهواء 0.1 ملليبار. ثم يتم توازن الأنابيب مع العينة.

إذا كان حجم العينة المتوفرة منخفضا، فقد يتم إعادة توازن الأنابيب بحجم واحد فقط. عينة أسبيرات. عادة ما يكون حجم الميت حوالي 30 ميكرولتر.

تبديل صمام واحد للاستغناء. الاستغناء عن العينة من خلال الأنابيب وفوهة. ثم يستنشق مقدار العينة المطلوبة لتشغيل واحد.

تبديل صمام واحد للاستغناء. تأكد من أن الرطوبة النسبية قد وصلت إلى القيمة المطلوبة. نحن عادة إعداد الشبكات في 60٪ أو أعلى.

هذا يمكن أن يستغرق بضع دقائق. ضع الملاقط التي تحمل شبكة متوهجة في الذراع المنغمسة. ضع الشريحة قياس القوة في موضع البداية، وعلى استعداد لقياس السرعة.

تعيين المشغل لقياس السرعة في برنامج الذبذبات. ضع كوب الإيثان السائل، وعلى مقربة من غرفة الرطوبة. تأكد من أن مسار المكبس واضح.

بدء التشغيل في برنامج التحكم. عند الانتهاء من تشغيل، اضغط OK'in برنامج التحكم للافراج عن الضغط من الذراع يغرق. فتح غرفة الرطوبة، وتخفيف الصلة بين الذراع يغرق وملاقط.

تحريك الذراع يغرق مع الحفاظ على الشبكة في الإيثان السائل. ثم نقل الشبكات إلى النيتروجين السائل وإلى التخزين. حفظ قياس الذبذبات.

يدويا إعادة تعيين موقف شريط التمرير عداد القوة والغطاس. كرر البروتوكول لإعداد الشبكات المتماثلة. ويتم إجراء التجارب التي تم حلها زمنيا بطريقة مماثلة.

هناك حاجة إلى تركيزات أعلى للمخزون للتجارب التي تم حلها زمنيا بسبب التخفيف في خطوة الاختلاط. لإجراء تجربة تم حلها زمنيا، استخدم جميع المحاقن الثلاث. يتم إرفاق أنابيب لمضخات الحقنة وفوهة رذاذ.

فوهة رذاذ microfluidic المستخدمة هنا يحتوي أيضا على عنصر خلط. لاحظ أن أنابيب أطول سوف تعطي أكبر الميت الحجم وغسل خطوات التوازن تتطلب المزيد من العازلة وعينة. توازن جميع المحاقن مع العازلة وعينة على حدة.

عادة، يتم استخدام حقنة واحدة لعينة A'and المحاقن اثنين وثلاثة وتستخدم لعينة B'After الأنابيب هو متساوية، تحميل عينة A في حقنة واحدة وعينة B في المحاقن اثنين وثلاثة. ثم قم بتبديل الصمامات من واحد إلى ثلاثة للاستغناء عنها. بدء التشغيل في برنامج التحكم.

لاحظ أن هناك حاجة إلى برنامج نصي تشغيل مختلفة لتجربة حل الوقت. ويمكن تحقيق تأخيرات زمنية مختلفة بطريقتين. عن طريق ضبط سرعة المكبس، يمكن تغيير تأخير الوقت من الاختلاط إلى التجميد.

سرعة الهبوط الأسرع ستؤدي إلى تأخير أقصر في الوقت. بدلا من ذلك، يتم تغيير مسافة الإيثان رذاذ عن طريق ضبط الموقف الرأسي للرذاذ فوهة. زيادة المسافة سيؤدي إلى تأخير وقت أطول.

في المجهر الإلكتروني عند التكبير المنخفض ، تبدو الشبكة النموذجية مثل هذا. مناطق الجليد الرقيقة، كما هو مبين، مناسبة للحصول على البيانات. في التكبير الأعلى، يجب أن تكون الجسيمات مرئية بوضوح.

مع عينة اختبار مثل أبوفيريتين، مجموعة بيانات صغيرة نسبيا من شبكة واحدة كافية لإعادة الإعمار في دقة angstrom ثلاثة إلى أربعة. بالنسبة للتجارب التي تم حلها زمنيا، نقوم بتجميع مجموعات البيانات من نقاط أو شبكات زمنية مختلفة. من المفيد الجمع بين البيانات لتصنيف ثلاثي الأبعاد ومن ثم تتبع الجسيمات إلى نقاطها الزمنية.

وبهذه الطريقة يمكن أن توفر البيانات معلومات هيكلية ومعلومات عن الحركية رد الفعل. في الختام، نأمل أن تكونوا قد استمتعتم بالفيديو. نأمل أنه مع الأوصاف التفصيلية في ورقة JoVE جنبا إلى جنب مع الفيديو ، ستتمكن من إجراء تجاربك الخاصة عبر صنع الشبكة السريعة ، والتي ثبت أنها تخفف من بعض المشاكل الناجمة عن الطفرة أو المساعدة في التفاعلات في واجهة الهواء والماء ، كل ما تحتاجه لإجراء دراساتك الخاصة التي تم حلها زمنيا لمحاولة اعتراض بعض حالات عدم التوازن هذه.

لذا، صنع شبكة سعيدة.