طرق المجهر متعددة الوقت لتوصيف الفقاعات الدقيقة ذات العلامات الفلورية لإطلاق المخدرات التي تسببها الموجات فوق الصوتية

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوصيف استجابة الفقاعات الدقيقة المسماة بالفلورسنت والمصممة لتطبيقات توصيل الأدوية التي تعمل بالموجات فوق الصوتية والتي تشمل آليات التنشيط و النفث الحيوي. يكمن المفتاح في الجمع بين تقنيات التصوير التي تسمح لنا بكشف المشكلة متعددة النطاق لتوصيل الأدوية التي تسببها الموجات فوق الصوتية مع الفقاعات ، سواء على نطاقات مكانية مختلفة أو على نطاقات زمنية مختلفة. لتصوير فقاعة واحدة من قبل المجهر برايتفيلد، ضع إبرة تنفيس قياس 19 واستخدام حقنة ملليلتر واحد مجهزة إبرة قياس 19 لإزالة كمية صغيرة من تعليق microbubble من قارورة الزجاج إلى أنبوب صغير لتسهيل pipetting في الخطوة التالية.

باستخدام ماصة، تمييع محلول الفقاعات الدقيقة في الفوسفات المصفى المالح المخزنة مؤقتا. استخدم حقنة 10 ملليلتر لحقن العينة في منفذ واحد لحامل العينة حتى يمتلئ الحامل دون إنشاء فقاعات هوائية ، وحقن المزيد من العينة إذا لزم الأمر. أغلق كلا صمامي حامل العينة وضع حامل العينة عموديا على المحور البصري للمجهر.

قبل تحليل العينة، قم بتعيين تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية المطلوب والضغط الصوتي على مولد الشكل الموجي التعسفي وبدءا بمجال الرؤية في زاوية واحدة من حامل العينة، استخدم مرحلة XYZ لتحريك الحامل لتحديد موقع الفقاعات الصغيرة المفردة في مجال رؤية المجهر، ثم إرفاق ألياف بصرية متصلة بحمام مائي بضوء القوية وبدء التسجيل. كرر التصوير عدة مرات كما هو مطلوب لكل إعداد الموجات فوق الصوتية، ونقل حامل العينة ما لا يقل عن ملليمترين إلى مجال الرؤية التي تحتوي على الفقاعات الدقيقة غير الصوتية لكل تحليل. للتصوير المجهري الفلوري للفقاعات الدقيقة، بعد تمييع محلول microbubble في الفوسفات العازلة المالحة كما هو موضح ، تعيين تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية المطلوب والضغط الصوتي على مولد الموجي التعسفي وتعيين تأخير الزناد لليزر على مولد تأخير النبض لإثارة الفلورسينس من الجسيمات النانوية من microbubbles ، ثم استخدم مرحلة XYZ لنقل حامل العينة لتحديد موقع الفقاعات الدقيقة الواحدة وجعلها في بؤرة التركيز الهدف، ثم تشغيل التسجيل.

كرر التصوير كما هو مطلوب عن طريق تغيير إعدادات الموجات فوق الصوتية ونقل حامل العينة إلى مجال الرؤية الجديد كما هو موضح. للتصوير عن طريق المجهر داخلفيتال، أول موقف حامل الحيوان ساخنة على مرحلة تحديد المواقع XY بين دليل الموجة والهدف وإضافة هلام اقتران لدليل الموجة. أدخل قسطرة وريد الذيل في وريد الذيل لفأر مخدر حامل للورم ووضع الماوس المزود بغرفة نافذة في الحامل الساخن.

أضف قطرة ماء إلى غطاء الغطاء. لتصور الأوعية الدموية أنسجة الورم، حقن عن طريق الوريد 30 ميكرولتر من أربعة ملليغرام لكل ملليلتر الفلورسنت المسمى 2 ميجادالتون دكستران في القسطرة الوريد الذيل واستخدام مرحلة الترجمة XY لتحريك الماوس حتى يمكن تحديد مجال الرؤية مع الأوعية الدموية المناسبة. ضبط معدل الإطار ومجال الرؤية وطول التسجيل وفقا لمعلمات التجربة وتسجيل صور خط الأساس للسفن.

عندما تم الحصول على صور خط الأساس، تعيين تردد القيادة بالموجات فوق الصوتية، وطول النبض، وسعة الضغط الصوتي على مولد الموجي التعسفي وحقن عن طريق الوريد 50 ميكرولتر من عينة microbubble في الوريد الذيل. ثم صورة الأوعية الدموية كما هو موضح. تحليل الفقاعات الدقيقة عن طريق المجهر الفلوري confocal يكشف عن توزيع الجسيمات غير موحدة من قذيفة microbubble.

يمكن تصور الهيكل العام للفقاعات الدقيقة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني. تحليل الديناميات الإشعاعية والسلوك الظواهري للفقاعات الدقيقة الرنانة من قبل المجهر برايتفيلد يسمح بتقييم التغير النسبي في دائرة نصف قطرها microbubble مع مرور الوقت. هنا، يظهر تسلسل صورة لتسليم ناجح نموذجي للجسيمات النانوية المسماة بالفلورسنت.

يمكن ملاحظة الجسيمات النانوية المضمنة في قشرة الفقاعات الدقيقة للفلورس عندما يصل ضوء الليزر إلى الفقاعة. كما لوحظ في هذا التسليم غير الناجح ، ومع ذلك ، فإن الجسيمات النانوية الفلورية خفيفة على قشرة الفقاعات الدقيقة ، والتي لا تزال سليمة أثناء التعرض للموجات فوق الصوتية. يمكن استخدام التصوير متعدد الفوتونات داخل الفيتون لتحديد البذخ المكاني والزماني للجسيمات النانوية أثناء التعرض بالموجات فوق الصوتية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لفهم وتحسين الآليات الكامنة وراء تسليم الجسيمات النانوية بوساطة الموجات فوق الصوتية.

مع المحاذاة المثالية للمسارات البصرية والصوتية على جميع المقاييس الطولية والوقتية ، يتم توفير نظرة شاملة على تسليم الأدوية التي تسببها الموجات فوق الصوتية. الإجابات التي تقدمها تجاربنا متعددة النطاق سوف تترجم الآن إلى الممارسة السريرية. وستوفر النتائج رؤية قيمة لمجموعة من التطبيقات العلاجية، بما في ذلك علاج السرطان.