سير عمل الفحص السريع لتحديد العلاج المركب المحتمل ل GBM باستخدام الخلايا الجذعية الدبقي المشتقة من المريض
مارس 28, 2021
الخلايا الجذعية الورم الدبقي (GSCs) هي جزء صغير من الخلايا السرطانية التي تلعب أدوارا أساسية في بدء الورم، وتولد الأوعية، ومقاومة الأدوية في الورم الأرومي الدبقي (GBM)، ورم الدماغ الأولي الأكثر انتشارا وتدميرا. وجود GSCs يجعل GBM الحرارية جدا لمعظم العوامل الفردية المستهدفة، لذلك هناك حاجة إلى طرق فحص عالية الإنتاجية لتحديد العلاجات مزيج فعالة محتملة. يصف البروتوكول سير عمل بسيط لتمكين الفحص السريع للعلاج المركب المحتمل مع التفاعل التآزري. الخطوات العامة لسير العمل هذا تتكون من إنشاء GSCs لوسيفيراز الموسومة، وإعداد لوحات
الخلايا الجذعية الدبقية هي مجموعة فرعية من الخلايا في الورم الدبقي ، والتي عادة ما تكون مقاومة للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي. هنا وصفنا طريقة التحديد السريع للعلاجات المركبة ، واستهداف الخلايا الجذعية الورم الدبقي ، بدلا من الخلايا الدبقية المتمايزة. بالمقارنة مع غيرها من الأساليب ، والتي قد تكون شاقة ومعقدة.
هذا البروتوكول هو بسيط نسبيا وسريع، لتحديد تركيبات المخدرات مفيدة محتملة. ابدأ بجمع الخلايا الجذعية الدبقية أو GSCs من وسيط الثقافة ، والطرد المركزي عند 70 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة supernatant، هضم الخلايا مع accutase لمدة أربع دقائق في 37 درجة مئوية.
باستخدام طرف 200 ميكرولتر، ماصة الخلايا مرارا وتكرارا للتفكك، وإعادة إنفاق بيليه الخلية. أضف GSCs بكثافة 200,000 خلية في ملليلتر واحد من وسيط الثقافة ، إلى كل بئر من لوحة ثقافة الآبار ال 12 ، واحتضانها بين عشية وضحاها. أوه في اليوم التالي ، إضافة 30 ميكرولتر من فيروس لوسيفيراز - eGFP supernatant في كل بئر من لوحة.
الطرد المركزي الخلايا في 1000 مرة G لمدة ساعتين، في 25 درجة مئوية واحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل الوسط في الآبار بجمع GSCs، والطرد المركزي منها، وإزالة الناموس، وإعادة إنفاقها في وسط جديد، وإعادة صياغتها. ثقافة الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى.
مراقبة لوحة تحت المجهر الفلورسنت وتأكيد ظهور الخلايا إيجابية GFP. فرز وجمع GSCs مع مضان عالية باستخدام فرز خلية تدفق والثقافة لهم كذلك. معطف، 96 لوحات أسفل البصرية جيدا مع خليط مصفوفة خارج الخلية، مثل matrigel، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
إزالة الخليط الزائد وشطف بلطف لوحات مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم البذور XG387-لوك الخلايا في كثافة 1000 خلية في 100 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة، وإلى كل بئر من لوحات المغلفة والثقافة لهم بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، مراقبة الخلايا تحت المجهر لتأكيد تعلقها لوحة. المقبل إعداد 200 ميكرومولار تيموزولوميد الحل واثنين من حلول الميكروفولار من العوامل المستهدفة، في وسط الثقافة.
لفحص المخدرات الجمع، وإزالة المتوسطة فارغة وإضافة المتوسطة التي تحتوي إما 200 تيموزولوميد ميكرومولار أو اثنين من الكائنات الدقيقة المستهدفة عامل، أو مزيج من كليهما، في كل بئر لثلاثة تكرارات التقنية لكل علاج. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. التقاط صور للإضاءة الحيوية الخلوية في لوحة باستخدام نظام التصوير الطيف IVIS.
باستخدام البرمجيات المدمج في، وخلق مناطق دائرية متعددة من المنطقة ذات الاهتمام وتحديد الإضاءة الحيوية الخلوية. لتحديد المرشحين المحتملين التي يمكن أن تعزز تأثير الورم الأرومي الأنجليوومي من تيموزولوميد، تم تحليل 20 مثبطات جزيء صغير انتقائية الهدف من خلال فحص تركيبة المخدرات. وكانت قيم المؤشر الحساسة ل 13 وكيلا مستهدفا أعلى من الصفر وخمسة منها أعلى من 0.1.
وكان المؤشر الحساس لأكبر عقارين مرشحين UMI-77 و A 83-01 أعلى من 0.25 ، مما يشير إلى إمكاناتهما للتآزر مع تيموزولوميد. تم تقييم العلاج المشترك للتيموزولومايد وUMI-77 باستخدام م المقايسة المضادة للتكاثر في مصفوفة المعايرة ستة في ست جرعات. قيم الفهرس المركبة كانت أقل من واحد.
وكانت قيم العامل الواحد العالية أكبر من الصفر بالنسبة لمعظم تركيبات تيموزولوميد وUMI-77 بتركيزات مختلفة. مما يشير إلى تفاعل تآزري شامل بين تيموزولوميد وUMI-77 في كل من XG387 وXG328 GSCs. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول في العثور على تركيبة المخدرات باستخدام الخلايا السرطانية الملتصقة ببساطة عن طريق إزالة لوحة طلاء الخطوة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستعرض هذه المقالة بروتوكولاً مبسطاً للتحديد السريع لمجموعات الأدوية التآزرية التي تستهدف الخلايا الجذعية الورمية الدبقية (GSCs) في الورم الأرومي الدبقي (GBM). يعتمد سير العمل على استخدام خلايا GSCs موسومة باللوسيفيريز، وأطباق مغلفة بالـ matrigel، وفحص عالي الإنتاجية يعتمد على التلألؤ البيولوجي لتقييم فعالية العلاجات المجمعة، وذلك بهدف التغلب على مقاومة خلايا GSCs للعلاجات التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا السرطان
- أبحاث الخلايا الجذعية
- اكتشاف الأدوية
- أورام الجهاز العصبي
خلفية علمية
- تُعد الخلايا الجذعية للورم الدبقي مجموعة فرعية ضمن أورام الورم الأرومي الدبقي، وتساهم في بدء تكوين الورم، وتكون الأوعية الدموية، ومقاومة العلاج.
- تظهر الخلايا الجذعية للورم الدبقي (GSCs) مقاومة شديدة للعلاجات الموجهة ذات العامل الواحد، مما يستلزم تطوير علاجات تركيبية.
- غالبًا ما تكون الطرق التقليدية لفحص العقاقير في الخلايا الجذعية للورم الدبقي مجهدة ومعقدة.
- هناك حاجة إلى بروتوكولات فحص سريعة وفعالة لتحديد تركيبات دوائية فعالة ضد الخلايا الجذعية للورم الدبقي.
الغرض من الدراسة
- تأسيس سير عمل بسيط وسريع لفحص تركيبات الأدوية التآزرية المحتملة التي تستهدف الخلايا الجذعية الورمية الدبقية (GSCs).
- التحقق من قدرة البروتوكول على تحديد التركيبات التي تعزز التأثير المضاد للورم الأرومي الدبقي للعلاجات القياسية.
- إثبات إمكانية تطبيق البروتوكول على كل من الخلايا الجذعية الورمية الدبقية (GSCs) والخلايا السرطانية الملتصقة.
الطرق المستخدمة
- عزل واستزراع الخلايا الجذعية للورم الدبقي من خطوط خلوية معروفة.
- نقل فيروس luciferase-eGFP إلى الخلايا الجذعية للورم الدبقي من أجل التصوير بالتلألؤ البيولوجي.
- فرز الخلايا الجذعية للورم الدبقي الموجبة لبروتين GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي.
- استزراع الخلايا الجذعية للورم الدبقي في أطباق ذات 96 بئراً مغلفة بالماتريجيل لإجراء فحص العقاقير.
- المعالجة بـ temozolomide، أو العوامل الموجهة، أو مزيج منهما في مكررات تقنية.
- قياس التلألؤ البيولوجي الخلوي باستخدام نظام التصوير IVIS spectrum وتحليل تآزر العقاقير باستخدام قيم مؤشر الحساسية ومؤشر التآزر.
النتائج الرئيسية
- تم فحص عشرين مثبطاً جزيئياً صغيراً مستهدفاً بالاشتراك مع عقار temozolomide.
- أظهر ثلاثة عشر عاملاً قيم مؤشر حساسية إيجابية، حيث تجاوزت خمسة منها قيمة 0.1.
- أظهر كل من UMI-77 و A 83-01 أعلى درجات التآزر مع temozolomide (مؤشر الحساسية > 0.25).
- كانت قيم مؤشر التركيبة لـ temozolomide و UMI-77 أقل من واحد، مما يشير إلى تأثيرات تآزرية مضادة للتكاثر في خطوط متعددة من GSC.
الاستنتاجات
- يتيح البروتوكول الموصوف تحديداً سريعاً وفعالاً لمجموعات الأدوية التآزرية التي تستهدف GSCs.
- يعد كل من UMI-77 و A 83-01 مرشحين واعدين للعلاج المركب مع temozolomide في حالات GBM.
- يمكن تكييف سير العمل هذا للاستخدام مع الخلايا السرطانية الملتصقة عن طريق حذف خطوة طلاء الطبق.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
إن التحديد السريع لمجموعات الأدوية ذات التأثير التآزري التي تستهدف الخلايا الجذعية للورم الدبقي (GSCs) يعالج عقبة حرجة في تطوير علاجات الورم الأرومي الدبقي (GBM). يتيح سير العمل هذا إجراء فحص كمي عالي الإنتاجية لتقليل المخاطر المرتبطة باستراتيجيات الدمج الدوائي ضد الخلايا المسببة للأورام شديدة المقاومة. ويدعم دمج هذا الفحص في مرحلة مبكرة من مسار العمل الثقة التنبؤية وفرز المحفظة العلاجية لـ GBM وأنواع أخرى من السرطانات المستعصية.
التطبيقات الاستراتيجية في الأبحاث الصيدلانية الحيوية&د
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكّن من استقصاء الفرضيات العلاجية التي تركز على آليات المقاومة التي تحركها الخلايا الجذعية الورمية الدبقية (GSC).
- يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال الاختبار المباشر للتآزر الدوائي في المجموعات الخلوية الجذعية ذات الصلة بالمرض.
- يُسهّل التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال قراءات كمية للحيوية والانتشار.
- يعزز الثقة التنبؤية لدفع أنظمة العلاج المركبة في محافظ علاج الورم الأرومي الدبقي (GBM).
الفحص وتطوير المقايسة
- تجهيز أنظمة GSC موسومة باللوسيفيريز ومعتمدة لضمان تدفقات عمل قوية في عمليات الفرز اللاحقة.
- توحيد ظروف المقايسة باستخدام أطباق مغلفة بالماتريجيل ومكررات تقنية لضمان قابلية التكرار.
- توليد مخرجات كمية للتلألؤ البيولوجي لإجراء تقييم ومقارنة موثوقة للمركبات.
- تمكين الفرز عالي الإنتاجية والقابل للتوسيع لتركيبات دوائية متعددة بشكل متوازٍ.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- يوائم مخرجات الفحص مع بيولوجيا الخلايا الجذعية الورمية (GSC) ذات الصلة بالمرض لضمان الاستمرارية الانتقالية.
- يدعم التقدم المعدل حسب المخاطر للعلاجات المدمجة في نماذج GBM قبل السريرية.
- يوفر تخفيفاً للمخاطر الميكانيكية من خلال تأكيد التآزر في خطوط متعددة من الخلايا الجذعية الورمية (GSC) المشتقة من المرضى.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يربط سير عمل الفحص هذا بين مرحلة الاكتشاف المبكر وتحديد المركبات الواعدة من خلال تمكين التقييم الكمي السريع للتآزر الدوائي في خلايا GSCs المشتقة من المرضى. وتساهم المخرجات في توجيه أولويات الدراسات قبل السريرية واستراتيجيات المؤشرات الحيوية الانتقالية لعلاجات GBM المركبة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات في المقاومة التي تقودها الخلايا الجذعية السرطانية (GSCs).
- المسح: توفر بيانات تلألؤ بيولوجي كمية وقابلة للتكرار لفرز المركبات.
- التحليلات: توفر قيم مؤشر حساسة ومؤشر تركيب لمقارنة التآزر عبر الظروف المختلفة.
- البحث الانتقالي: تحافظ على الصلة المرضية من خلال استخدام خلايا جذعية سرطانية (GSCs) مشتقة من المرضى وبروتوكولات قابلة للتكيف مع الخلايا السرطانية الملتصقة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر منصة قابلة لإعادة الاستخدام والتوسع للمسح التركيبي عبر محافظ أبحاث الأورام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في تطوير العلاج المركب.
- القيمة التشغيلية: تسهل عملية الفرز من خلال تدفقات عمل موحدة وقابلة للتطوير والتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أفضل بشأن الاستمرار أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال التركيز على التوليفات التآزرية في مرحلة مبكرة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بعلاجات GBM الواعدة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في استزراع الخلايا الجذعية السرطانية (GSC)، والنقل الفيروسي، وقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا.
- يتطلب الوصول إلى أنظمة التصوير بالتلألؤ البيولوجي وبرمجيات تحليلية للحصول على قراءات كمية.
- يستلزم توحيداً قياسياً بين الفرق في إعداد المقايسة وبروتوكولات تحليل البيانات.
- قابل للتكيف مع نماذج سرطانية أخرى عن طريق تعديل خطوات طلاء الأطباق وتحضير الخلايا.
- يعتمد على توفر خطوط الخلايا الجذعية السرطانية (GSC) المشتقة من المرضى ومكتبات المركبات المعتمدة.
