مضان المجهر لات الداخلي ATP بوساطة Macropinocytosis في خلايا الورم البشري والفئران الورم xenografted

الخلايا السرطانية لديها قدرة ملحوظة على استيعاب المواد الغذائية، مثل ATP، من البيئة خارج الخلية. يسمح لنا البروتوكول لدينا بإظهار استيعاب ATP وتصور توطين ATP داخل الخلايا. هذا التصوير عالي الدقة ل ATP الداخلي ، داخل macropynozomes ، مثالي لفهم التعريب الخاص واستكمال كمية تحليل الاستيعاب.

يصف البروتوكول التطبيقات التجريبية المختلفة لدراسة استيعاب ATP. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة آليات مختلفة من الاستيعاب الخلوي ، بما في ذلك داء الكلى وداء الغدد الصماء بوساطة خارجية. بالنسبة للأمراض الأيضية ، يمكن دراسة استيعاب ATP في الخلايا غير السرطانية مع هذا البروتوكول.

للبدء، قم بزرع الخلايا السرطانية في قارورة مساحتها 225 سنتيمترا مربعا، تحتوي على DMEM مكملة ب FBS والمضادات الحيوية. السماح للخلايا بالنمو عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في حاضنة زراعة الخلايا. مرة واحدة يتم تحقيق التقاء 80٪، فصل الخلايا بيليه أسفل الخلايا فصل عن طريق الطرد المركزي، وإعادة إنفاق الخلايا في الجليد البارد PBS لتحقيق كثافة الخلية من 5 مرات 10 إلى 6 خلايا لكل 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.

نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر من جهاز الطرد المركزي. تنظيف موقع الحقن على الجناح من الماوس المناعي، مع 75٪ الإيثانول، ومسح الإيثانول الزائد مع مسح مهمة حساسة. ارسم الخلايا في حقنة واحدة خالية من اللاتكس بالملليلتر، مجهزة بإبرة انزلاق دقيقة قياس 27.

للحقن تحت الجلد، أمسك الإبرة بزاوية 10 درجات تقريبا على الجلد وأدخل طرف الإبرة مع شطبة تواجه أسفل الجلد، مع الحفاظ على واحد إلى ملليمترين فقط من الإبرة خارج الجلد. الاستغناء عن الخلايا من الحقنة ببطء على مدى ما يقرب من 10 ثانية. بعد حقن وحدة التخزين بأكملها، أمسك الإبرة في مكانها لمدة ثلاث إلى خمس ثوان ثم اسحب الإبرة.

تطبيق ضغط لطيف ولكن ثابت على موقع الحقن لمدة ثلاث إلى خمس ثوان مع الأصابع، لمنع تسرب المحتوى عن طريق الحقن. رصد وقياس نمو الورم باستخدام الفرجار فيرنييه، حتى تصل الأورام إلى حجم 200 إلى 500 ملليمتر مكعب. حل 300 ميكرولتر من 16 ملليغرام لكل ملليلتر عالية الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran وDMEM خالية من المصل، واحتضان في حمام مائي، خفف في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم، الطرد المركزي حل dextran ونقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر من الطرد المركزي.

في 40 ميكرولتر، وهو سهم واحد ملليمولار غير قابلة للتحلل الفلورسنت ATP التناظرية إلى 160 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل، لجعل 0.2 ملليمولار غير قابلة للهيدروليزلار الفلورسنت ATP الحل. إعداد حلول العلاج من DMEM أو ثمانية ملليغرام لكل ملليلتر عالية أو منخفضة الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran، مع أو بدون 100 ميكرومولار غير قابلة للهيدروليز الفلورسنت ATP في DMEM، عن طريق خلط حلول الأسهم التي أعدت سابقا. استخدم حقنة ملليلتر واحدة لجمع 50 ميكرولتر من محلول علاج واحد.

حقن الحل مباشرة في ورم xenograft وكرر لأربعة تكرار البيولوجية من كل علاج. بعد القتل الرحيم للفأر وعزل أنسجة الورم ، استخدم ملعقة مثقبة لاستخراج أنسجة الورم المكروبة ووضع الأنسجة على الفور في وسط متجمد ولفة الأنسجة ، مما يضمن بقاء الأنسجة مغمورة في الحمامات المتوسطة ، وجميع أسطح الأنسجة. ضع الأنسجة بعناية في قالب التضمين الذي يحتوي على وسيط التجميد.

ضع علامة التسمية المقابلة عموديا في الوسط المتجمد أو القالب، مع التأكد من أن الملصق المكتوب مرئي خارج الوسط. عندما يتحول الوسط المتجمد إلى اللون الأبيض المبهم، قم بإزالة كتلة الأنسجة من القالب، وضع كتلة الأنسجة على الجليد الجاف وكرر التجميد لكل قسم ورم. تخزين كتل الأنسجة في ناقص 80 درجة مئوية لعدة أشهر قبل إجراء عملية استئصال الشعر.

بعد إجراء الشرائح من كتل الأنسجة، إصلاح الشرائح قسم الأنسجة في الإيثانول 95٪ في ناقص 18 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. اغسل القسم الثابت مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. إضافة 10 إلى 50 ميكرولتر من وسط تصاعد مائي مع DAPI إلى أقسام الأنسجة، وفقا لحجم الأقسام، ووضع زلة غطاء زجاجي على قسم الأنسجة.

بعد 12 إلى 24 ساعة من التركيب ، حدد المناطق ذات الاهتمام بأقسام الأورام الثابتة والحصول على الصور باستخدام المجهر الفلوري كما هو موضح سابقا. بعد ساعتين إلى 24 ساعة من تثبيت الخلايا السرطانية البشرية والوقوف مع DAPI ، التقط الصور باستخدام نظام تصوير الفلورسينس وبرامج الحصول على البيانات. ضع الشريحة على خشبة مسرح المجهر المستقيم في وضع المنظار.

افتح برنامج التصوير، وحدد هدف 10 مرات، واضبط المرحلة لتحديد التركيز البؤري. مسح الشريحة من اليسار إلى اليمين بطريقة ثعبانية لتحديد المناطق ذات الاهتمام. حدد هدف 40 مرة، واستخدم التبديل على المجهر للتبديل من وضع المنظار إلى وضع التقاط الصور.

انقر على أيقونة جودة العيش لعرض الصور والحصول عليها في وقت لاحق. استخدم لوحة OC على شريط أدوات الاقتناء لتحديد معلمات التعريض الضوئي لكل مكعب فلتر أو قناة فلورية ، ثم استخدم شريط أدوات الاستحواذ متعدد القنوات للحصول على صورة ثلاث قنوات مع إعدادات التعرض المحددة. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على صور متعددة القنوات يدويا عن طريق تحويل بين مكعبات التصفية، وتحديد وقت التعرض، وإغلاق أو فتح الغالق بين الحصول على صورة لكل قناة وتراكب كل صورة مأخوذة لقنوات فردية.

حفظ الصورة كملف nd2. حفظ ملفات TIF، بما في ذلك صورة القناة المدمجة وصور القناة الفردية. استخدم ميزة عدد الكائنات على شريط أدوات التعليقات التوضيحية والقياسات لحساب عدد NHF-ATP و TMR عالية الوزن الجزيئي الفلوري dextran و TMR منخفضة الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran الخلايا الإيجابية على ملف صورة nd2 المحفوظة وتصدير البيانات إلى جدول بيانات من خلال برنامج التحليل.

وقد تم تطوير هذا البروتوكول للتحليل المكاني والزمني والكمي للتدخيل الخلوي لATP غير قابلة للهيدروليز. وقد تجلى الاستيعاب داخل الخلايا من ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليز من خلال كولوكاليس من ATP الفلورسنت غير قابلة للهيدروليز مع عالية أو منخفضة الوزن الجزيئي الفلورسنت dextran في المختبر، السابق فيفو وفي الجسم الحي. لضمان أن الخلايا السرطانية تحتفظ ATP استيعابها, وقت محدود التجريبية لجميع الحقن داخل الرحم إلى تضمين التبريد.

أيضا حساب للاختلاف داخل الرحم عن طريق تصوير الأنسجة في جميع أنحاء الورم. يمكن أن تنطوي التكرارات المستقبلية لطريقتنا على تصور في الوقت الحقيقي لعملية استيعاب E-ATP ، والكشف عن معلومات حول الحركية الضامة والاتجار في أنسجة محددة.