استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases

عرض Phage لا يساعدنا فقط على التحقيق في الخصائص الملزمة للإنزيمات المهمة سريريا ، ولكن أيضا تطوير المغيرات لتلك الإنزيمات والأمراض المقابلة لها. يمكن استخدام شاشة Phage لتطوير ملفات جديدة لمجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة ، كما أنه أسهل في الأداء من طرق العرض التقليدية الأخرى. هذا الإجراء ينطوي على الكثير من العمل المتكرر، وبالتالي فإن المفتاح هو عدم الطيار الآلي والبقاء مركزة في جميع أنحاء.

ابدأ بتطعيم 30 ملليلتر من مرق التتراسيكلين 2YT مع 200 ميكرولتر من ثقافة البذور. احتضانه لمدة ثلاث ساعات تقريبا في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة حتى تكون البكتيريا في مرحلة منتصف السجل. تجاهل حل الطلاء من لوحة في بالوعة.

جففه برفق مع المناشف الورقية. ثم إضافة 200 ميكرولتر من PB العازلة لكل المغلفة جيدا. تجاهل العازلة PB من لوحة وتجفيفه على المناشف الورقية.

إضافة 200 ميكرولتر آخر من العازلة PB إلى كل بئر المغلفة من لوحة. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة. إذابة مكتبة phage على الجليد ، ثم تمييعها إلى 100X تنوع المكتبة في PBS.

أضف محلول كلوريد الصوديوم البولي إيثيلين غليكول في خمس حجم المكتبة المخفف واحتضان المحلول على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، طرد مركزي الحل في 11، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant والطرد المركزي لمدة دقيقتين أخريين لسحب أسفل supernatant المتبقية وتركيز بيليه phage.

إعادة إنفاق بلطف بيليه phage في ملليلتر واحد من PBT العازلة لكل بروتين الهدف ليتم تحليلها، وعادة ما تكون أربعة في المجموع. إضافة 100 ميكرولتر من مكتبة phage إلى كل المغلفة جيدا في لوحة التحكم. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.

تجاهل المخزن المؤقت PB من لوحة الهدف في الحوض وتجفيف لوحة على المناشف الورقية. نقل جميع ميكرولتر 100 من مكتبة phage في لوحة التحكم إلى كل بئر المغلفة من لوحة الهدف. احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك، قم بإزالة مكتبة phage من اللوحة واغسل الآبار المغلفة أربع مرات مع مخزن PT المؤقت. عكس لوحة والاستفادة على منشفة ورقية لإزالة قطرات الماضي من العازلة. إضافة 100 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المولر 0.1 إلى كل المغلفة جيدا لe elute phage.

احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق مع اهتزاز مداري 300 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، تحييد الحموضة بإضافة 12.5 ميكرولتر من الحموضة 11 واحد الضرس تريس هيدروكلوريد إلى كل بئر المغلفة. نقل phage eluted من جميع الآبار الثمانية في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر الطرد المركزي.

ماصة صعودا وهبوطا أثناء النقل لجعل الحلول متجانسة و أسبيرات جميع السوائل من الآبار. إضافة 10٪ BSA إلى phage eluted لجعل التركيز النهائي 1٪ تخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق في أربع درجات مئوية. هذا هو الناتج الجولة الأولى.

إعداد ثقافة البذور لزراعة مدخلات phage للجولة التالية من الاختيار عن طريق تلقيح خمسة ملليلترات من ثقافة بذور التتراسيكلين 2YT مع مستعمرة E.coli معزولة من لوحة أجار. احتضانه بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. تمييع البروتين المستهدف في الجولتين الثانية وثلاثة أنبوب مع كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني.

خذ نصف محتويات الجولتين الثانية وثلاثة أنابيب ومعطف أربعة آبار لكل بروتين مستهدف في لوحة ملزمة 96 جيدا للجولة القادمة. بعد ذلك، استخدم نصف إخراج الجولة الأولى لتطعيم ثلاثة ملليلترات من خلايا مرحلة منتصف السجل. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة.

إضافة M13KO7 المساعد phage إلى تركيز النهائي من 10 مليار PFU لكل ملليلتر. احتضان مرة أخرى في 37 درجة مئوية لمدة ساعة مع 200 RPM اهتزاز المداري. بعد ساعة، نقل كامل ثلاثة ملليلتر من الثقافة إلى 30 ملليلتر من محلول الكاناميسين كاربينسيلين 2YT.

تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري 200 دورة في الدقيقة. تظهر النتائج التمثيلية لاختيار متغير ubiquitin مقابل UBE4B هنا. تم طلب UBVs من أعلى إلى أدنى تردد.

تمثل التسلسلات منطقة كل مكان متنوعة في UBV مع جميع المخلفات العشوائية. يتم قياس التقارب النسبي الملزم للموثقات بالبروتين المستهدف من النوع البري ، البروتين المستهدف المتحول ، وكذلك البروتينات غير المستهدفة من خلال فحوصات مناعية مرتبطة بالإنزيم أو ELISA. تم تطبيع جميع امتصاصات ELISA مقابل 96 متوسط درجات BSA ELISA و 96 متوسط درجات GST ELISA.

يمثل اللون الأخضر الداكن الربط النسبي الأقوى. تم تضمين GST كعنصر تحكم للربط غير المحدد لأن البروتين المستهدف هو علامة GST. يتم عرض نتائج ELISA بيانيا هنا.

يمثل المحور س UBVs ويمثل المحور ص امتصاص تسويتها المقابلة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ألا تتخلص من المحلول الموجود في اللوحة بعد إضافة حمض الهيدروكلوريك. يتم تعليق phages الآن في الحل وتريد الاحتفاظ بها حتى تتمكن من إجراء التحليلات النهائية اللاحقة للتخصيب أو كليهما.

بعد هذا الإجراء، يجب إجراء التسلسل لتحديد ترددات UBV. يمكن إجراء اختبارات ELISAs و IC50 لتحديد الفعالية الملزمة والفعالية المثبطة على التوالي وكذلك للمساعدة في تحديد UBVs التي يجب توصيفها بشكل أكبر.